急性髓系白血病（AML）中白血病干细胞（LSC）亚群的鉴定及其转录组、表观遗传与功能特性的研究

第一作者及单位
本研究由Héléna Boutzen（第一作者兼通讯作者）、Alex Murison、Alexa Oricuia等来自加拿大玛格丽特公主癌症中心（Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network）的研究团队完成，合作单位包括多伦多大学医学系、医学生物物理学系及分子遗传学系。论文于2024年8月发表于期刊《Leukemia》（2024年影响因子：38卷，2090-2101页），题目为《Identification of leukemia stem cell subsets with distinct transcriptional, epigenetic and functional properties》。

学术背景
急性髓系白血病（AML）的治疗长期面临复发难题，白血病干细胞（LSC）是疾病持续和复发的关键驱动因素。尽管LSC的异质性已被广泛认识，但既往研究多集中于遗传突变层面，而功能异质性（如细胞周期状态、化疗耐药性）的机制仍不明确。此外，LSC因缺乏可靠表面标志物和样本稀缺性，其分离与研究存在技术瓶颈。本研究基于患者来源的OCI-AML22细胞模型，结合单细胞多组学分析和功能实验，旨在揭示LSC的功能亚群及其临床意义。

研究流程与方法
1. 模型与样本选择
研究采用OCI-AML22细胞模型，该模型保留了原发性AML样本的LSC特征（如干细胞程序富集、异质性重现）。同时，纳入73例AML患者的分选样本（CD34+CD38-和CD34+CD38+细胞），通过异种移植实验（NSG小鼠）验证LSC功能。

1. 单细胞多组学分析

   • 技术方法：对7160个OCI-AML22 CD34+CD38-细胞进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）和染色质可及性测序（scATAC-seq），通过UMAP降维和ToomanyCells/ToomanyPeaks算法聚类。
     
   • 表观遗传分析：使用ChromVAR工具比较LT-HSPC（长期造血干细胞）和ACT-HSPC（激活态造血干细胞）表观特征，并通过CD112（疱疹病毒进入介质）表达差异区分亚群。
     

2. 功能验证实验

   • 体外克隆形成实验：单细胞培养显示CD34+CD38-细胞可分化为高CD34+保留的小克隆（低分化潜能）和低CD34+的大克隆（高分化潜能）。
     
   • 异种移植实验：通过限定稀释法注射CD112high和CD112low细胞，评估其在小鼠体内的再增殖动力学（8周 vs. 12周）和分化能力（CD34+比例）。
     
   • 化疗敏感性测试：阿糖胞苷（cytarabine）处理显示CD112low LSC具有更强的耐药性。
     

3. 临床数据关联

   • 通过基因集变异分析（GSVA）在73例患者中验证B1/2-LSC和B3-LSC特征，发现81%患者存在至少一种亚群，21%患者同时存在两种亚群。
     
   • 生存分析（TCGA和GSE6891队列）显示B1/2-LSC富集患者预后更差（p<0.05）。
     

主要结果
1. LSC亚群的分子特征
- B1/2-LSC：CD112low、深度静止（G0期）、高表达quiescence相关基因（如CDK6-），表观上富集LT-HSPC特征。
- B3-LSC：CD112high、高增殖活性（G2/M期富集）、染色质可及性与ACT-HSPC相似。

1. 功能差异

   • 再增殖能力：B3-LSC在小鼠中快速形成移植瘤（8周可检测），而B1/2-LSC需12周但长期竞争占优。
     
   • 化疗耐药：B1/2-LSC对阿糖胞苷的IC50显著高于B3-LSC（p<0.01），与临床预后差相关。
     

2. 临床意义

   • CD112表达可作为LSC亚群分离的生物标志物，其分选纯度达80%（FACS验证）。
     
   • 多亚群共存现象提示AML治疗需组合策略（如靶向静止期LSC的BCL-2抑制剂+常规化疗）。
     

结论与价值
本研究首次在单细胞层面解析了AML LSC的转录-表观-功能三维异质性，并确立CD112为可操作的分选标志物。科学价值在于：
1. 机制层面：揭示了LSC功能异质性与细胞周期调控的直接关联，为靶向静止期LSC提供新靶点（如CDK6）。
2. 临床转化：CD112分选策略可优化微小残留病（MRD）监测，而亚群特异性耐药特征指导个性化用药（如B1/2-LSC患者优先使用Venetoclax）。

研究亮点
1. 技术创新：首次整合scRNA-seq/scATAC-seq与功能性异种移植，开发了ToomanyCells算法（已开源）用于分支聚类。
2. 模型优势：OCI-AML22模型克服了原代样本稀缺性，兼具遗传和功能异质性。
3. 跨尺度验证：从单细胞机制到临床队列的多层次证据链（如GSVA评分与生存率关联）。

其他发现
表观遗传分析显示，B1/2-LSC的染色质封闭状态可能依赖DNMT3A/TET2通路（与既往AML甲基化研究吻合），此方向值得进一步探索。