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主要作者及发表信息
本研究由董毅（Yi Dong）、付荣（Rong Fu）等人作为共同第一作者完成，通讯作者为金晶（Jing Jin）、陈晓光（Xiaoguang Chen）及徐恒（Heng Xu）。该研究成果于2021年10月22日在线发表于药物化学领域的权威期刊《Journal of Medicinal Chemistry》（J. Med. Chem. 2021, 64, 16626−16640）。
一、 研究的学术背景与目标
本研究聚焦于肿瘤免疫治疗领域。该领域的核心目标是克服肿瘤微环境（TME）中的免疫抑制，重新激活人体自身的免疫系统以杀伤肿瘤细胞。CXC趋化因子受体2（CXCR2）是一种G蛋白偶联受体，其在多种炎症性疾病和肿瘤发展中扮演着关键角色。近年来，越来越多的证据表明，CXCR2信号通路在将髓系来源的抑制细胞（MDSCs）招募至肿瘤微环境的过程中至关重要，而MDSCs的大量浸润会导致T细胞介导的免疫应答被显著抑制，从而实现肿瘤的免疫逃逸。因此，CXCR2已成为一个极具潜力的癌症免疫治疗新靶点。已有几个小分子CXCR2拮抗剂，如SX-682和AZD5069，进入了针对实体瘤的临床试验，通常与抗PD-1抗体等免疫检查点抑制剂联合使用。
尽管已有结构多样的CXCR2拮抗剂被报道，其中二芳基脲系列研究最为深入，且该系列的三个临床候选分子（SB-332235, SB-656933, GSK1325756）均具备一个与酚羟基相邻的磺酰胺/砜基结构，该结构对提高化合物活性和改善药代动力学性质至关重要。然而，这些化合物尚未推进至癌症免疫治疗的临床试验。因此，本研究旨在利用环化策略，设计和合成一类具有新型苯并环状砜骨架的二芳基脲类似物，以替代原有的邻氯取代芳基砜部分。这一结构改造旨在实现构象限制并降低分子量，从而发现具有更强效和更优抗癌免疫活性的CXCR2拮抗剂。
二、 研究的工作流程与详细方法
本研究的实施遵循了一条完整的从药物设计、化学合成、体外活性评价、药代动力学评估到体内药效及机制研究的逻辑链条。
1. 分子设计与化学合成 研究团队首先基于构效关系（SAR）和合成可行性，利用环化策略设计了饱和与非饱和两种类型的苯并环状砜衍生物。合成工作共涉及五种通用路线（方案1-5）。首先，从苯并[d]噁唑-7-磺酰氯（化合物13）出发，通过还原、硫醚化、傅克酰基化、氧化等步骤构建关键的三环噁唑砜中间体17。随后，针对不同目标化合物分化合成路径：为获得8a和8b，直接将中间体17水解开环，暴露出邻氨基酚结构（中间体18），再与异氰酸酯反应得到目标脲类化合物。为构建饱和苯并环状砜系列（9a-k），中间体17经硼氢化钠还原、脱水得到不饱和环状砜20，再经催化氢化得到饱和中间体21，随后酸解脱保护得到另一个邻氨基酚中间体22，最后与不同取代的异氰酸酯缩合生成终产物。将脲基替换为方酰胺的化合物（10a-e）则是通过3，4-二氯环丁-3-烯-1,2-二酮与不同芳胺缩合生成中间体24，再与中间体22偶联合成。不饱和苯并环状砜系列衍生物（11a-k）则是直接利用不饱和的环状砜20进行水解，得到邻氨基酚中间体25，再与异氰酸酯反应制得。对称的不饱和方酰胺衍生物（12a-e）的合成方法类似。
本研究中的创新方法主要体现在分子设计层面，即采用环化策略构建苯并环状砜骨架，这是一种全新的化学结构改造方式，旨在通过构象限制来优化配体-受体的结合。此外，关键的中间体17的合成与向其衍生物的转化构成了该研究的核心技术流程。所有目标化合物的结构均经过核磁共振氢谱（1H NMR）、碳谱（13C NMR）和高分辨质谱（HRMS）确证，关键化合物9b和11h的结构还通过单晶X射线衍射（XRD）分析得到进一步确认（图6）。
2. 体外CXCR2拮抗活性和选择性评价 这是研究流程中的第一个评价环节。所有合成的目标化合物均使用稳定表达人源重组CXCR2的细胞，通过β-抑制蛋白招募实验（β-arrestin assay）评估其拮抗活性，并以半数抑制浓度（IC50）表示。同时，计算了每个化合物的脂水分配系数（c Log P）和拓扑极性表面积（TPSA），以初步评估其成药性。 随后，对代表性化合物进行了更深入的评价：（1）通过使用人源重组CHO-K1细胞进行放射性标记的[125I]-IL-8配体竞争结合实验，测定化合物的抑制常数（Ki），验证其是否直接结合至CXCR2靶点。（2）利用已报道的CXCR2晶体结构（PDB ID: 6LFL），对先导化合物9b和11h进行了分子对接分析，以预测其结合模式。（3）通过β-抑制蛋白实验对化合物9b和11h以及阳性药SB-332235进行了CXCR1的拮抗活性测试，以评估其对高度同源的CXCR1的选择性。（4）将化合物9b在一个包含19种趋化因子受体的筛选板上进行了激动和拮抗模式的活性筛选，以评估其全面的选择性谱。
3. 体内药代动力学（PK）研究和外排模型评估 基于体外活性结果，选择先导化合物9b和11h进行体内评价。首先在ICR小鼠上进行了药代动力学研究，给药方式为静脉注射（3 mg/kg）和口服灌胃（30 mg/kg），测定了包括达峰时间（Tmax）、峰浓度（Cmax）、药时曲线下面积（AUC）、半衰期（T1/2）和口服生物利用度（F）在内的关键PK参数。 随后，采用小鼠气囊模型（air pouch model）评估化合物在活体条件下对CXCR2功能的拮抗作用。该模型通过注射2%角叉菜胶诱导急性炎症，从而趋化中性粒细胞向气囊内浸润。化合物9b、11h和阳性药SB-332235以不同剂量（3, 10, 30 mg/kg）在造模期间连续口服给药，通过分析灌洗液中的中性粒细胞计数来评价药物的体内药效。
4. 体内抗肿瘤活性和免疫作用机制研究 这是研究的核心药效验证环节。采用Pan02小鼠胰腺癌模型，该小鼠品系为C57BL/6。荷瘤小鼠被随机分组后，分别给予化合物9b（10和30 mg/kg）和11h（3和10 mg/kg），每日口服两次，持续15天。通过定期测量肿瘤体积，计算肿瘤生长抑制率（TGI）来评估抗肿瘤效果。 为阐明其作用机制，给药15天后处死小鼠，收集肿瘤组织进行免疫细胞分析。采用流式细胞术对肿瘤组织浸润的中性粒细胞、粒细胞样MDSCs和单核细胞样MDSCs的群体比例进行定量分析。同时，采用免疫组织化学分析，通过荧光显微镜观察和计数肿瘤组织中MDSCs和中性粒细胞的浸润情况。至关重要的是，还通过流式细胞术分析了肿瘤组织中CD3+ T淋巴细胞的浸润变化，以检验药物是否增强了适应性免疫应答。此外，为排除直接的细胞毒作用，还测试了先导化合物9b和11h对Pan02、PANC-1、SW1990、BxPC3、MIA PaCa-2等多种胰腺癌细胞系以及外周血单个核细胞（PBMC）的增殖抑制活性。
三、 主要研究结果
1. 构效关系（SAR）探索结果 β-抑制蛋白实验显示，饱和系列的母核中，去除4-位羰基可显著提高活性（如8a vs 9a: IC50 0.40 μM vs 0.21 μM）。在苯并环状砜骨架上，对右侧苯环的取代基进行了系统优化：2-位卤素（Cl, Br）取代对活性有利（9d, IC50 = 0.21 μM; 9e, IC50 = 0.14 μM），而4-位取代（如Br或Me）则导致活性大幅下降或丧失（9g, IC50 >10 μM）。尤为关键的是，2-氯-3-氟双取代的化合物9k（IC50 = 0.043 μM）将活性提升至42 nM水平，与前期SAR规律一致。将脲基团替换为方酰胺基团后，所有对应化合物的活性均显著下降。不饱和系列的苯并环状砜衍生物普遍比饱和系列更优，活性提升约3倍（如11b vs 9d: IC50 0.066 μM vs 0.21 μM）。其中，2-甲基-3-氟（11h）和2-氯-3-氟（11j）双取代化合物的活性最为突出，IC50分别达到34 nM和28 nM，与阳性药SB-332235水平相当。将不饱和系列的脲替换为方酰胺同样导致活性急剧下降。所有化合物的c Log P值在1.5-3.6之间，TPSA在95-115 Ų之间，均处于口服药物可接受的范围内。
2. 作用机制与选择性验证结果 放射性配体结合实验结果显示，9b和11h对CXCR2的Ki值分别为1.24 μM和0.44 μM，证实它们能直接结合受体。分子对接研究揭示了9b和11h与CXCR2胞内端的变构口袋结合，并与Ser81、Thr83、Asp84和Lys320四个氨基酸残基形成氢键网络（图3）。重要的是，与SB-332235和SB-656933相比，9b和11h的苯并环状骨架并未引入额外的空间效应，能被结合口袋很好地容纳。选择性分析表明，9b和11h对CXCR1的选择性超过100倍（IC50 > 10 μM）。在19种趋化因子受体的广谱筛选中，9b在10 μM浓度下仅对CXCR2显示出完全抑制，对CCR1有较弱的抑制（49%），证实了其优异的靶点选择性。
3. 体内PK与药效学结果 小鼠PK数据显示（表4），化合物9b和11h的半衰期（T1/2）均大于3小时，前药性质合理。尽管其暴露量和口服生物利用度（9b为6.1%，11h为23.2%）低于阳性药SB-332235（35.0%），但仍支持进一步体内测试。在气囊模型中（图4），9b和11h均能以剂量依赖方式显著抑制中性粒细胞浸润，在10 mg/kg剂量下药效与SB-332235相似，证实其在体内能有效拮抗CXCR2。
4. 体内抗肿瘤疗效及免疫机制结果 在Pan02胰腺癌模型中（图5），化合物9b（10和30 mg/kg）和11h（3和10 mg/kg）均以剂量依赖性方式显著抑制肿瘤生长。其中，9b高剂量组的TGI为61.4%，11h高剂量组的TGI为66.7%。流式细胞术和免疫组织化学分析一致表明，9b和11h能够显著且剂量依赖性地减少肿瘤组织中中性粒细胞和粒细胞样MDSCs的浸润（图5b-e），但不影响单核细胞样MDSCs。最为关键的是，两种化合物均能剂量依赖性地显著提高肿瘤组织内CD3+ T淋巴细胞的浸润（图5f,g），揭示了其抑制肿瘤生长的免疫学机制。此外，细胞毒性实验显示，9b和11h在浓度高达10 μM时对所测试的肿瘤细胞和正常PBMC均无直接杀伤作用，这从反面支持了其体内抗肿瘤效果源于重塑肿瘤免疫微环境，而非直接的细胞毒性。
四、 研究结论与价值
本研究的结论是，通过新颖的环化策略成功设计并合成了一系列饱和及非饱和的苯并环状砜衍生物，它们是一类新型、高效且具有口服活性的CXCR2拮抗剂。深入的体外SAR研究揭示了决定活性的关键结构要素，并成功鉴定出两个先导化合物9b和11h。在Pan02小鼠胰腺癌模型中，它们通过减少免疫抑制性的中性粒细胞及MDSCs的浸润、增加杀伤性的CD3+ T细胞的浸润，实现了剂量依赖性的肿瘤抑制效果。这一机制研究表明，该类CXCR2拮抗剂能够将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤，通过重编程免疫微环境来激发T细胞介导的抗肿瘤免疫应答。
该研究的学术价值在于，它不仅验证了环化策略在二芳基脲类CXCR2拮抗剂设计中的可行性，为后续药物化学优化开辟了新的化学空间，而且通过完整的从结构设计到体内免疫机制研究的实验证据链，有力地证实了CXCR2作为癌症免疫治疗靶点的可行性。其应用价值在于，9b和11h作为具有优秀体内活性和明确作用机制的先导化合物，为开发新型癌症免疫治疗药物奠定了坚实基础，有望与现有的免疫检查点抑制剂联用，为对现有疗法响应不佳的患者提供新的治疗方案。
五、 研究亮点
本研究的主要亮点可归纳为四点： 1. 新颖的结构设计： 首次采用环化策略，将传统二芳基脲CXCR2拮抗剂中的开链芳基砜部分改造为苯并环状砜，这一策略不仅降低了分子量，还可能通过构象限制效应增强了配体与受体的结合，为一个经典药效团的结构修饰提供了新的成功范例。 2. 完整的证据链： 研究构建了从计算机辅助药物设计、化学合成、体外活性及选择性评价、体内药代/药效学，到利用详细的免疫细胞分析（流式细胞术和免疫组化）阐述抗肿瘤免疫机制的完整链条，逻辑清晰，论证严密。 3. 机制的明确性： 与前代化合物相比，本研究不仅停留在抗肿瘤药效层面，而是明确揭示了其通过抑制MDSCs和中性粒细胞向肿瘤的趋化，从而促进CD3+ T细胞浸润的免疫激活机制，为CXCR2拮抗剂的抗肿瘤作用提供了直接且深入的免疫学解释。 4. 优秀的全面选择性： 化合物9b在19种趋化因子受体的大规模筛选中展现出卓越的选择性，仅对靶点CXCR2有完全抑制活性，这极大地降低了潜在的脱靶效应风险，提升了其作为候选药物的开发潜力。此外，通过晶体学和对接分析，在分子层面确认了其独特的结合模式，为理解其活性和选择性提供了结构基础。