学术研究报告：一种新型肽中心TCR模拟物的从头设计与结构研究

作者及机构
本研究的通讯作者为斯坦福大学医学院分子与细胞生理学系的K. Christopher Garcia教授，第一作者为Karsten D. Householder等。合作团队包括斯坦福大学医学院免疫学项目、计算机科学系及霍华德休斯医学研究所（HHMI）的多名研究者。研究成果于2025年7月24日发表于《Science》期刊（卷375）。

学术背景
本研究属于肿瘤免疫治疗领域，聚焦于T细胞受体（TCR）模拟物（TCR mimic, TcRM）的设计。TCR通过识别肿瘤细胞表面肽-MHC复合物（pMHC）触发免疫反应，但天然TCR存在亲和力低、易脱靶等问题。传统抗体类TcRM虽能提高亲和力，却因过度依赖MHC结合而引发脱靶毒性。为此，研究团队提出了一种全新策略：利用α-螺旋结构从头设计肽中心TcRM，以精准靶向NY-ESO-1肿瘤抗原（由HLA-A*02递呈），同时降低脱靶风险。

研究流程与方法
1. TcRM的从头设计
- 计算建模：使用RFdiffusion生成50个单体α-螺旋束（80-100个氨基酸），通过视觉筛选紧密折叠的候选结构。选定最佳模板后，以NY-ESO-1-HLA-A*02为靶标，通过RFdiffusion的折叠条件优化生成100种四螺旋束结构。
- 序列优化：采用ProteinMPNN为每个结构生成6条序列（共600种设计），再通过AlphaFold2预测结合界面，以界面预测对齐误差（IPAE≤10.0）筛选出4种高置信度支架。
- 实验验证：将排名前5的设计通过酵母展示筛选，其中两种（mini-TcRM 1.1和1.2）表现出对NY-ESO-1的特异性结合（KD=9.5 nM），且不与无关肽（如MART-1）结合。

1. 结构解析与机制分析

   • 晶体结构：通过2.05 Å分辨率的X射线晶体学解析mini-TcRM 1.1与pMHC复合物结构，发现其以40°倾斜角类似天然TCR的对接模式，31%的界面面积集中于肽段（如Met4-Trp5疏水口袋），并通过氢键网络稳定结合。
     
   • 对比分析：与抗体类TcRM（3m4e5 Fab）和天然TCR（1g4）相比，设计的α-螺旋TcRM结构更刚性，且肽段接触更集中，可能减少构象熵损失导致的脱靶。

2. 脱靶评估与治疗应用

   • 计算预测：基于晶体结构，对14,363种HLA-A*02肽进行Hamming距离筛选，发现7种潜在脱靶肽，其中两种（PIP5K1A和KIRREL2来源）经实验证实弱结合。
     
   • 功能验证：将mini-TcRM 1.1构建为双特异性T细胞衔接器（TCE），在NY-ESO-1存在下激活T细胞（EC50=9.1 nM），而对脱靶肽的激活阈值显著降低（EC50=174 nM）。此外，以CAR-T形式展示时，可特异性杀伤NY-ESO-1+黑色素瘤细胞。

主要结果与逻辑链条
- 设计阶段：计算工具（RFdiffusion/ProteinMPNN）的高效组合实现了快速TcRM生成，IPAE筛选与实验验证的吻合性（如AlphaFold预测与晶体结构的RMSD=0.41 Å）验证了方法的可靠性。
- 结构机制：晶体结构揭示了肽中心结合的关键残基（如Asn80与Thr7氢键），解释了特异性高于传统TcRM的原因。
- 治疗潜力：TCE和CAR-T实验证明，设计的TcRM在纳摩尔级浓度下即可激活T细胞，且对脱靶肽的选择性窗口显著（10 nM时仅靶向NY-ESO-1）。

结论与价值
1. 科学价值：首次证明α-螺旋支架可作为TcRM的替代平台，其刚性结构和高设计效率为免疫治疗提供了新思路。
2. 应用价值：
- 诊断：快速生成肿瘤抗原特异性探针，加速患者分层。
- 治疗：通过计算预筛选脱靶肽，可缩短个性化疗法开发周期（如基于外显子测序的实时设计）。
3. 技术革新：深度学习工具（RFdiffusion/ProteinMPNN）与实验验证的闭环流程，将传统抗体筛选的耗时从数月缩短至数周。

研究亮点
1. 创新设计：首次实现从头设计的α-螺旋TcRM，突破抗体支架的限制。
2. 方法学优势：结合AI工具与结构生物学，30小时内生成2600种设计，实验验证周期仅1-2周。
3. 临床意义：为实体瘤免疫治疗提供了兼具高亲和力与低脱靶毒性的候选分子。
4. 扩展性：α-螺旋支架的模块化特性支持多价或多特异性药物开发，如几何精确的T细胞功能调控剂。

其他价值
- 免疫原性管理：虽需进一步评估合成蛋白的免疫原性，但可通过计算表位预测优化降低风险。
- 技术普适性：该平台可推广至其他pMHC靶点，尤其适用于罕见突变肽的快速靶向。