该研究由来自上海交通大学医学院附属瑞金医院骨科、上海市骨与关节疾病重点实验室的Zhuochao Liu、Hongyi Wang等学者共同完成，合作单位还包括同济大学附属第十人民医院骨科。研究成果于2021年发表在期刊《Cell Death & Disease》（卷12期164页），文章标题为《靶向自噬增强atezolizumab诱导的骨肉瘤线粒体相关凋亡》。
学术背景
骨肉瘤（Osteosarcoma, OS）是青少年最常见的原发性恶性骨肿瘤，19岁以下人群发病率达4.675例/百万。尽管手术技术不断进步，但药物治疗仍沿用1970年代方案，患者5年生存率长期停滞。PD-L1（程序性死亡配体-1）作为免疫检查点分子，通过结合PD-1抑制T细胞抗肿瘤免疫。虽然PD-L1抗体在黑色素瘤等实体瘤中疗效显著，但在骨肉瘤的临床试验（SARC028研究）中响应率仅5%，提示需深入探究其作用机制。
既往研究多关注PD-L1抗体的免疫调节功能，但近年发现PD-L1在肿瘤细胞中具有直接促存活作用，包括调控代谢、维持干性和激活自噬等。本研究聚焦PD-L1单抗atezolizumab的免疫非依赖性作用，旨在揭示其直接诱导骨肉瘤细胞凋亡的机制，并探索联合自噬抑制剂的增效策略。
研究流程与方法
1. 细胞模型构建与表型分析
- 研究对象：人骨肉瘤细胞系HOS和143B（ATCC来源），培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基。
- 处理方案：设置0-40 μg/mL梯度浓度的atezolizumab处理24小时，通过CCK-8法和克隆形成实验检测增殖抑制；流式细胞术（Annexin V-FITC/PI双染）定量凋亡率。
- 关键发现：Atezolizumab呈剂量依赖性抑制增殖（IC50：HOS=12.3 μg/mL；143B=15.7 μg/mL），凋亡率最高提升至对照组的7.3倍（HOS：1.58%→11.61%）。
2. 线粒体功能与凋亡机制研究
- 超微结构观察：透射电镜显示线粒体嵴肿胀、空泡化（红色箭头标记）。
- 功能检测：JC-1染色显示线粒体膜电位（ΔΨm）显著下降（红绿荧光比值降低60%），伴随ROS释放增加（流式检测阳性率提高3倍）和SOD活性降低（下降45%）。
- 信号通路：Western blot检测到cytochrome-c（细胞色素c）释放、caspase-9/3剪切体表达上调；磷酸化JNK水平升高2.8倍，而JNK抑制剂SP600125可逆转上述表型。
3. 自噬激活与调控实验
- 自噬标志物检测：LC3-II/I比值上升（2.1倍）、p62降解（下降65%），电镜观察到自噬体数量增加。
- 机制验证：通过GFP-RFP-LC3双标系统证实自噬流增强（黄色/红色斑点增加），而线粒体抗氧化剂Mito-Tempo可部分抑制该效应。
- 功能干预：使用氯喹（CQ，10 μM）或ATG-5 siRNA阻断自噬后，凋亡标志物cleaved-caspase-3表达进一步升高（1.8倍），TUNEL阳性率提升至联合组的28.5%（单药组16.2%）。
4. 动物模型验证
- 实验设计：SCID小鼠皮下移植HOS细胞（2×10^6/只），分组为PBS对照、CQ单药（50 mg/kg）、atezolizumab单药（10 mg/kg）及联合组（n=5）。
- 结果：联合组肿瘤体积最小（较单药组减少42%），Ki-67阳性率下降62%，TUNEL阳性率提高至35.7%。氧化应激检测显示MDA含量升高（2.3倍），但联合组未进一步增加ROS水平。
主要结果与逻辑关联
- 凋亡诱导机制：Atezolizumab通过损伤线粒体→ROS/JNK通路激活→cytochrome-c释放→caspase级联反应触发凋亡。该过程独立于免疫调节功能，为PD-L1抗体的新作用机制。
- 自噬的双刃剑效应：过量ROS激活保护性自噬，此为肿瘤细胞抵抗atezolizumab毒性的逃逸途径。通过药理学（CQ）或遗传学（ATG-5 siRNA）抑制自噬可增强凋亡效应。
- 转化医学价值：体内实验证实联合方案显著优于单药，为临床提高PD-L1抗体疗效提供新策略。
结论与价值
本研究首次揭示atezolizumab在骨肉瘤中的双重作用：既通过线粒体途径直接诱导凋亡，又触发保护性自噬削弱其疗效。联合自噬抑制剂可突破肿瘤防御机制，使肿瘤细胞对PD-L1抗体敏感化。该发现具有重要科学价值： 1. 理论创新：拓展了对PD-L1抗体非免疫依赖作用的认识，提出”线粒体损伤-自噬反馈”调控轴。 2. 临床意义：为PD-L1抗体低响应率的骨肉瘤患者提供联合治疗依据，氯喹作为已上市的自噬抑制剂具有快速转化潜力。
研究亮点
- 多维度机制解析：从超微结构（电镜）、功能（膜电位/ROS）、分子（JNK/自噬流）多层次阐明atezolizumab的作用网络。
- 创新实验体系：建立稳定表达GFP-RFP-LC3的骨肉瘤细胞系，实现自噬流的动态监测。
- 转化研究闭环：从体外机制到动物模型，最终提出可临床验证的联合方案。
其他价值
研究涉及中国学者自主研发的技术：通过CRISPR-Cas9构建ATG-5敲低细胞系，并采用国产试剂盒（碧云天）完成氧化应激指标检测，体现本土科研工具的可靠性。伦理审批号由上海交通大学医学院附属瑞金医院提供（未公开编号），符合国际规范。