该研究由香港中文大学生物医学学院的Hui Zhao教授团队主导完成，第一作者为Yuan Zhang。研究团队还包括来自中国科学院广州生物医药与健康研究院、华东师范大学、宁夏医科大学等多个机构的合作者。该研究成果于2026年4月发表在Molecular Therapy期刊上，题为“A synthetic hyperglycemia-sensing gene circuit enhances blood glucose homeostasis in diabetic mice”。研究聚焦于合成生物学在糖尿病治疗中的应用，开发了一种能够感知高血糖并自动调节治疗蛋白表达的人工基因回路。
糖尿病（Diabetes Mellitus, DM）是以血糖异常升高为特征的代谢性疾病，预计到2045年全球将有超过6.93亿成年人受其影响。1型糖尿病（Type 1 Diabetes, T1D）源于胰岛β细胞的自身免疫性破坏，而2型糖尿病（Type 2 Diabetes, T2D）则主要由胰岛素抵抗引起。现行治疗手段面临诸多局限：外源性胰岛素注射存在低血糖风险且需频繁校准剂量；胰高血糖素样肽-1（Glucagon-Like Peptide-1, GLP-1）类药物虽可改善T2D，但其体内半衰期短，需反复给药。近年来，合成生物学的发展为智能药物递送提供了新思路。已有研究报道了基于钙通道等β细胞特异性组件的葡萄糖响应基因回路，但这些系统可能因表达β细胞特异性抗原而面临免疫原性风险。本研究旨在利用一种在哺乳动物细胞中普遍存在且高度保守的葡萄糖感应机制——O-GlcNAc糖基化（O-GlcNAcylation）介导的Yes相关蛋白（Yes-Associated Protein, YAP）核转位——构建一种正交性更好、免疫原性更低的高血糖感应基因回路，以实现胰岛素或GLP-1的按需表达与递送。
本研究的工作流程可分为四个主要阶段：基因回路的设计与体外功能验证、回路结构优化与机制确认、稳定细胞系的构建与微囊化封装、以及体内疗效与安全性评价。
第一阶段：基因回路的初始设计与体外表征。 研究团队首先构建了两个嵌合转录因子：TetR-TEADΔTEA和YAP-VPminx4。TetR-TEADΔTEA由DNA结合域TetR与YAP结合域TEADΔTEA融合而成，并带有核定位信号；YAP-VPminx4则在YAP蛋白N端融合了四个重复的转录激活肽段VPminx4。其设计逻辑是：在高糖条件下，YAP-VPminx4发生O-GlcNAc糖基化并转位入核，与TetR-TEADΔTEA结合，进而通过TetR与VPminx4的协同作用激活TetR依赖性启动子（PhCMV*-1）下游的报告基因或治疗基因表达。研究团队首先在HEK293T细胞中验证了该系统仅在有高糖刺激时激活GFP表达，证明了对葡萄糖的选择性响应。随后，通过荧光素酶报告基因实验检测了葡萄糖浓度梯度（2.5 mM至47 mM）下的表达水平，发现相对荧光素酶活性随葡萄糖浓度升高而增加，从2.5 mM到47 mM诱导倍数达3.89倍。分泌型碱性磷酸酶（Secreted Alkaline Phosphatase, SEAP）实验进一步显示，从2.5 mM到15 mM葡萄糖SEAP活性升高3.54倍，且系统在10 mM以上才显著激活，而在5 mM以下保持低活性，这一阈值恰好与人类正常空腹血糖（<5.6 mM）和糖尿病诊断标准（>11.1 mM）相吻合。研究团队还在HeLa、COS1、CHO-K1等多种哺乳动物细胞系中验证了该回路的广泛适用性，并测试了底物特异性——只有D-葡萄糖能诱导表达，葡萄糖类似物、脂肪酸和氨基酸均无此效果。然而，可逆性实验发现，当葡萄糖浓度在2.5 mM和15 mM之间循环变化时，靶基因表达不能完全逆转，提示第一版回路存在宿主细胞内源性信号的干扰。
第二阶段：回路结构优化与机制验证。 正交性分析揭示，YAP-VPminx4（第一版）含有全长YAP蛋白，会干扰内源性YAP信号通路。YAP响应性荧光素酶报告实验（8×GTIIC-luc）证实了第一版转录因子与内源性YAP信号存在显著串扰，且能上调内源性YAP靶基因CTGF、CYR61和ANKRD1的表达。为解决这一问题，研究团队设计了第二版回路：移除YAP的转录激活域（AD），构建TetR-YAPδAD；同时将VPminx4融合到缺失DNA结合域的TEADΔTEA上，构建TEADΔTEA-VPminx4。第二版设计使YAP/TAZ响应性报告活性恢复正常，且不再影响内源性YAP靶基因的表达水平。优化后的回路可逆性显著改善，在高糖（15 mM）与低糖（2.5 mM）循环时能更有效地关闭基因表达，且诱导倍数从3.54提高到4.13。后续机制验证实验表明，高糖处理（15 mM）可显著增加Flag-TetR-YAPδAD的O-GlcNAc修饰水平，提高其核/质分布比，并促进与TEADΔTEA-VPminx4-HA的共免疫沉淀。这些结果表明，第二版基因回路确实通过高糖诱导的O-GlcNAc糖基化和核转位来激活转录。
第三阶段：稳定细胞系的构建与微囊化封装。 研究团队利用睡美人（Sleeping Beauty）转座子系统将高血糖感应胰岛素基因回路（TetR-YAPδAD、TEADΔTEA-VPminx4和PhCMV*-1-mINS2-pA）稳定整合到HEK293T细胞基因组中。通过qPCR确认了基因插入，并基于SEAP表达和胰岛素表达进行两轮单克隆筛选，最终获得高糖诱导胰岛素表达最佳的细胞株。同时，构建了稳定表达高血糖感应GLP-1基因回路的细胞株。在体内移植前，工程化HEK293T细胞通过微流控装置被包封在藻酸盐-明胶微珠中（直径约150 μm，每微囊约140个细胞），以保护细胞免受宿主免疫攻击。封装后细胞保持了葡萄糖响应性和高活力，在体外培养14天仍维持良好状态。
第四阶段：体内疗效与安全性评价。 在T1D模型中，研究团队使用链脲佐菌素（Streptozotocin, STZ）诱导的C57BL/6J小鼠，将微囊化工程细胞经腹腔注射移植。结果显示，T1D-CL组（移植治疗细胞组）的空腹血糖在21天观察期内显著低于T1D对照组；在第8天和第14天的腹腔葡萄糖耐量试验中，T1D-CL组在120分钟时的血糖水平显著低于T1D组；非空腹血清胰岛素水平显著高于T1D组且与野生型小鼠相当。在T2D模型中，使用db/db小鼠移植表达GLP-1的工程细胞。T2D-CL组空腹血糖从第2天到第21天均显著低于T2D组；第14天葡萄糖耐量显著改善；血清活性GLP-1水平在第4天至第15天显著高于T2D组；胰岛素抵抗指数（Homeostatic Model Assessment of Insulin Resistance, HOMA-IR）在第21天显著降低。两组模型均未观察到体重显著改变。安全性评估显示，将基因回路工程细胞移植入野生型小鼠后，血糖、体重、肝肾组织学及血清肝肾功能指标均无异常。
组织病理学分析进一步揭示了基因回路的治疗价值。在T1D模型中，H&E染色显示STZ诱导的胰岛结构损伤在T1D-CL组得到明显修复。免疫荧光染色定量分析表明，T1D-CL组胰岛素阳性细胞面积显著高于T1D组，胰高血糖素阳性面积显著降低，α/β细胞比例虽仍高于正常对照但较T1D组显著下降。肾脏方面，Masson三色染色和PAS染色显示T1D-CL组肾小球胶原沉积和糖原累积均显著减轻，肾小管扩张评分和胶原沉积面积显著降低。视网膜方面，Brn3a染色显示T1D-CL组视网膜神经节细胞密度恢复至正常水平；CD31全视网膜铺片染色显示T1D-CL组血管面积、血管密度等参数较T1D组显著降低。在T2D模型中，类似的保护效应亦被观察到：胰岛α/β比例显著下降，肾小球和肾小管损伤减轻，视网膜神经节细胞密度恢复，视网膜血管异常得到改善。心肌纤维化方面，尽管有改善趋势，但未达到统计学显著水平。
本研究成功构建了一种基于O-GlcNAc糖基化介导YAP核转位机制的正交性高血糖感应基因回路。该回路能够在体外和体内响应高糖刺激，按需表达并分泌胰岛素或GLP-1，有效改善T1D和T2D小鼠的血糖稳态，并减轻高血糖引起的胰岛、肾脏和视网膜等多器官损伤。该研究的科学价值在于：证明了利用哺乳动物细胞中普遍存在的保守代谢传感通路构建合成基因回路的可行性，为合成生物学在代谢疾病治疗中的应用提供了新范式。其应用价值在于：该系统不依赖β细胞特异性抗原，免疫原性风险较低，有望使用患者自体细胞进行工程化移植，避免了异体细胞移植的免疫排斥问题。此外，该基因回路原则上可扩展至其他治疗蛋白的递送，为个性化、智能化的细胞治疗提供了通用平台。
本研究的主要亮点体现在以下几个方面。第一，利用O-GlcNAc糖基化这一在哺乳动物细胞中高度保守的葡萄糖感应途径，避免了外源性β细胞组件的使用，降低了免疫原性风险。第二，通过结构域层面的理性设计实现了系统正交性的显著提升，消除了与内源性YAP信号通路的串扰。第三，将YAP介导的葡萄糖感应与TetR/TEAD嵌合转录调控系统有机结合，实现了对葡萄糖浓度阈值（约10 mM）的精准响应，与临床糖尿病诊断标准高度吻合。第四，通过微囊化封装技术实现了工程细胞的免疫隔离和长期存活，为临床应用提供了可行的递送策略。第五，在T1D和T2D两种模型中均验证了治疗蛋白表达和器官保护效果，证明了该平台对不同糖尿病类型和不同治疗蛋白的通用性。
研究团队在讨论中指出，转录调控型基因回路的响应速度慢于天然β细胞的即刻分泌，也慢于基于蛋白质分泌开关的系统（如葡萄糖激活单链胰岛素类似物开关，GAIS系统）。未来的基因回路设计应整合蛋白质快速释放与转录信号放大两大优势，以更好地模拟天然胰岛的快速、剂量依赖性胰岛素分泌动力学。此外，虽然藻酸盐微囊化已在使用，但囊内空间有限可能影响细胞长期存活和蛋白分泌。研究团队提出，腺相关病毒（AAV）或慢病毒载体介导的体内基因递送是更具转化潜力的替代策略，可直接转导内源性细胞（如肝细胞）以稳定表达该回路，避免外源细胞植入的复杂性和相关风险。这些思考为后续研究方向提供了明确指引。