Jonathan S. Gootenberg, Omar O. Abudayyeh（共同第一作者）等人于2018年4月27日在《Science》期刊发表了题为”Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6”的研究论文。该团队来自Broad Institute of MIT and Harvard、McGovern脑科学研究所等多家机构，通讯作者为张锋（Feng Zhang）。
该研究属于分子诊断技术领域，聚焦于核酸快速检测技术的开发。传统核酸检测技术存在灵敏度低、依赖复杂仪器、难以实现多重检测等问题。研究团队此前开发的SHERLOCK（Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing）技术虽能检测单分子核酸，但仍存在定量能力不足、依赖荧光检测设备等局限。基于此，本研究旨在开发SHERLOCKv2平台，通过整合多种CRISPR酶（Cas13、Cas12a）和辅助酶Csm6，实现更高性能的核酸检测。
研究人员系统表征了17种CRISPR-Cas13酶（包括3种Cas13a和14种Cas13b亚型）的切割偏好性。通过设计： - 同聚物报告分子（homopolymer reporters）筛选 - 二核苷酸基序（dinucleotide motifs）偏好性分析 - 随机RNA文库筛选 发现LwCas13a、PsmCas13b、CcaCas13b和AsCas12a四种酶可分别特异性识别AU、UC、AC和GA基序，据此构建四通道检测体系。实验验证显示，该体系可同时检测寨卡病毒（ZIKV）和登革热病毒（DENV）的ssRNA以及两种细菌DNA靶标（铜绿假单胞菌酰基转移酶基因和金黄色葡萄球菌热核酸酶基因），灵敏度达2 attomolar（aM）。
通过调节重组酶聚合酶扩增（RPA）的引物浓度（480 nM降至120 nM），发现低浓度引物可延缓扩增饱和，使荧光信号与输入浓度在aM范围内呈现线性关系（R²=0.9844）。进一步通过扩大RPA反应体积（达540 μL），实现了zeptomolar（zM）级检测限。
创新性地将III型CRISPR效应核酸酶Csm6引入检测体系： - 发现Cas13的切割产物带有2’,3’-环磷酸末端，可激活Csm6 - 设计保护性RNA激活剂（(A)6-(U)5），经LwCas13a切割后释放(A)6激活Csm6 - 优化后的Cas13-Csm6联用使信号强度提高3.5倍
开发基于FAM-生物素报告分子的试纸条检测系统： - 报告分子切割减少金标抗体在第一线的积累 - 未切割报告分子通过第二线的蛋白A捕获显示阳性信号 - 可在90分钟内实现2 aM灵敏度检测 应用于非小细胞肺癌（NSCLC）患者液体活检样本，成功检测EGFR基因L858R突变和19号外显子缺失突变。
以家族性腺瘤性息肉病（APC基因W421X突变）为模型： - 采用PspCas13b进行RNA编辑（REPAIR系统） - 用SHERLOCKv2同步实现基因分型和编辑效率监测 结果显示编辑效率达43%，且可通过多重检测量化编辑效果。
SHERLOCKv2平台具有三大突破： 1. 多重检测：通过正交CRISPR酶实现单反应四通道检测，成本降低4倍。 2. 超高灵敏度：结合Csm6放大和RPA优化，检测限达zM级（每毫升单分子）。 3. 现场应用：横向流动检测实现”样本进-结果出”的闭环操作。
该技术的科学价值在于： - 首次系统解析CRISPR酶的基序偏好性并实现工程化应用 - 开创Cas13-Csm6级联信号放大新机制 应用价值包括： - 传染病多重诊断（如ZIKV/DENV鉴别） - 癌症液体活检突变检测 - 野外GMO检测等场景
该研究通过多学科交叉（酶工程、微流控、诊断技术），建立了新一代核酸检测范式，相关试剂已通过Addgene向学术界开放共享。