本研究报告旨在介绍一项发表于 Cell Death Discovery 期刊（2021年，第7卷，第173期）的原创性研究成果。该研究由上海交通大学医学院附属同仁医院基础医学研究所、瑞金医院核医学科等机构的研究团队完成，主要作者包括甘桂芳、石兆鹏、刘丹、张少毅，通讯作者为朱辉、王玉刚与宓骏。
研究背景
肝细胞癌是全球范围内最常见的原发性肝癌类型之一，也是癌症相关死亡的主要原因。对于晚期或复发的肝癌患者，手术切除等根治性治疗手段往往不适用。索拉非尼作为首个获得美国食品药品监督管理局批准用于晚期肝细胞癌的一线靶向药物，是一种多激酶抑制剂，通过靶向RAF、VEGFR、PDGFR等信号通路来抑制肿瘤生长。然而，临床实践表明，索拉非尼仅能使不足30%的患者获益，且中位生存期仅延长3-5个月，其耐药性问题（包括原发性耐药和获得性耐药）是制约疗效的主要瓶颈。因此，寻找能够增敏索拉非尼疗效的策略或化合物，是改善肝癌治疗现状的迫切需求。
肿瘤干细胞，亦称肿瘤起始细胞，被认为是驱动肿瘤发生、维持肿瘤生长并介导化疗和靶向治疗耐药的关键细胞亚群。在肝癌中，表达如CD44、CD133、EpCAM等表面标志物的肿瘤干细胞已被证实与索拉非尼耐药密切相关。Wnt/β-catenin信号通路在维持干细胞自我更新能力方面起着核心作用，而磷酸肌醇3-激酶/Akt通路也被报道参与肿瘤干性（stemness）的调控，并且在索拉非尼耐药的肝癌细胞中存在Akt的异常活化。基于此，研究团队推测，靶向肿瘤干性可能是一种克服索拉非尼耐药的有效策略。
3-羟基邻氨基苯甲酸是色氨酸代谢途径中犬尿氨酸的一种衍生物。研究团队的前期工作发现3-羟基邻氨基苯甲酸能够抑制肝癌生长。在本研究中，他们旨在深入探究3-羟基邻氨基苯甲酸是否能通过降低肝癌细胞的干性，从而增强其对索拉非尼的敏感性，并阐明其潜在的分子机制。
研究流程与实验设计
本研究流程设计严谨，包含体外细胞实验、体内动物模型以及临床样本分析，系统性地验证了科学假设。
第一部分：确立索拉非尼耐药与肿瘤干性增强的关联。 首先，研究团队评估了四种经典肝癌细胞系对索拉非尼的敏感性。通过CCK-8细胞活力检测，他们发现SMMC-7721和PLC8024细胞的半数抑制浓度显著高于HepG2和Hep3B细胞，因此将前两者定义为索拉非尼耐药细胞，HepG2作为敏感细胞对照。接着，他们通过比较耐药细胞与敏感细胞的基因表达谱进行KEGG通路富集分析，发现Wnt信号通路和PI3K/Akt通路在耐药细胞中被激活，这两条通路均与干细胞自我更新密切相关。为直接验证干性增强，研究人员检测了干细胞标志物的表达。结果显示，在耐药细胞中，转录因子OCT4、NANOG以及醛脱氢酶的蛋白水平显著升高。流式细胞术进一步证实，耐药细胞中CD44和CD133双阳性细胞亚群的比例（SMMC-7721: 9.6%; PLC8024: 13.5%）远高于敏感细胞（HepG2: 0.71%; Hep3B: 1.25%）。此外，对临床索拉非尼耐药与敏感肝癌组织的免疫组化分析也显示，耐药组织中OCT4和NANOG的表达更高。这些结果共同证明，索拉非尼耐药与肝癌细胞干性增强存在关联。
第二部分：验证Wnt/β-catenin信号通路在介导耐药中的作用。 既然干性增强与耐药相关，且Wnt通路在耐药细胞中激活，研究团队进而探究了该通路的具体作用。他们发现，在耐药细胞和组织中，β-连环蛋白的蛋白水平以及糖原合成酶激酶3β的磷酸化水平均升高，表明Wnt/β-catenin信号通路活性增强。利用TOP/FOP荧光素酶报告基因实验也直接检测到耐药细胞中β-catenin的转录活性更高。为了功能验证，他们使用了Wnt通路抑制剂XAV-939。实验表明，XAV-939处理能够降低耐药细胞中β-catenin、OCT4和NANOG的蛋白水平，同时减少CD44+CD133+细胞亚群的比例。更重要的是，XAV-939处理显著降低了耐药细胞对索拉非尼的IC50值，并增强了索拉非尼对细胞克隆形成的抑制作用。这些结果说明，抑制活化的Wnt/β-catenin通路可以降低肿瘤干性，从而逆转索拉非尼耐药。
第三部分：探究3-羟基邻氨基苯甲酸对肿瘤干性的抑制作用。 研究核心是评估3-羟基邻氨基苯甲酸的效果。体外实验显示，3-羟基邻氨基苯甲酸能以剂量依赖的方式抑制SMMC-7721和PLC8024耐药细胞的活力和克隆形成能力。同时，它能够显著降低CD44+CD133+细胞亚群的比例，并下调OCT4、NANOG、SOX2、ALDH等多种干细胞标志物的表达。在体内实验中，给携带SMMC-7721移植瘤的裸鼠腹腔注射3-羟基邻氨基苯甲酸，能够显著抑制肿瘤生长（抑制率约69.35%），并且肿瘤组织中CD44+CD133+细胞比例以及OCT4和NANOG的表达也相应降低。这些证据确凿地表明，3-羟基邻氨基苯甲酸能够有效抑制索拉非尼耐药肝癌细胞的生长和干性。
第四部分：阐明3-羟基邻氨基苯甲酸的作用机制——通过抑制Akt活性来下调Wnt信号。 接下来，研究团队深入探索了3-羟基邻氨基苯甲酸抑制干性的分子机制。对经3-羟基邻氨基苯甲酸处理的细胞进行基因表达谱和KEGG分析，发现Wnt信号通路和“调节干细胞多能性通路”发生显著变化。后续的蛋白质印迹实验证实，3-羟基邻氨基苯甲酸能以时间和剂量依赖的方式抑制GSK3β/β-catenin信号通路，而对Hedgehog或Notch通路影响不大。由于Akt是GSK3β的上游调控因子，且已知在耐药细胞中活化，研究人员检测了Akt的磷酸化状态。结果显示，3-羟基邻氨基苯甲酸处理能有效降低Akt的磷酸化水平。为了建立因果联系，他们使用了Akt激活剂SC79。SC79可以逆转3-羟基邻氨基苯甲酸对Akt磷酸化和下游GSK3β/β-catenin通路的抑制作用。而Wnt抑制剂XAV-939又能抵消SC79对干细胞标志物OCT4表达的促进作用。这一系列实验构成了清晰的证据链：3-羟基邻氨基苯甲酸通过抑制Akt的磷酸化，进而抑制其下游的GSK3β/β-catenin信号通路，最终导致肿瘤干性下降。
第五部分：验证3-羟基邻氨基苯甲酸与索拉非尼的协同增敏效应。 最后，研究在体外和体内验证了联合治疗的疗效。CCK-8实验表明，50 μM的3-羟基邻氨基苯甲酸与索拉非尼联用，对耐药细胞生长的抑制作用显著强于任一药物单独使用，并且能够大幅降低索拉非尼的IC50值。联合处理还能更有效地下调干细胞标志物ALDH、SOX2和OCT4的表达，并更大幅度地减少CD44+CD133+细胞亚群。在动物模型中，索拉非尼与3-羟基邻氨基苯甲酸联合用药比单药更能有效抑制移植瘤的生长。机制上，Wnt通路激活剂CHIR99021可以恢复被联合治疗所抑制的Akt/GSK3β/β-catenin信号和干细胞标志物表达，并削弱联合治疗的抗肿瘤效果，这反过来证明了该信号通路是3-羟基邻氨基苯甲酸发挥增敏作用的关键靶点。
研究结论与意义
本研究得出的核心结论是：3-羟基邻氨基苯甲酸能够通过抑制Akt/GSK3β/β-catenin信号通路，降低肝癌细胞的干性，从而显著增强索拉非尼耐药肝癌细胞对索拉非尼的敏感性，在体外和体内均展现出良好的协同抗肿瘤效应。
这项研究的科学价值在于：首先，它从肿瘤干细胞的角度为索拉非尼耐药提供了一个新的解释框架，并证实靶向干性是克服耐药的有效途径。其次，它首次发现并系统阐明了代谢物3-羟基邻氨基苯甲酸在增敏索拉非尼方面的全新作用和具体分子机制，即通过靶向Akt-Wnt轴来削弱肿瘤干性。这为理解色氨酸代谢产物在肿瘤微环境中的复杂功能增添了新的视角（不同于其前体犬尿氨酸的促癌作用）。
其潜在的应用价值非常显著：3-羟基邻氨基苯甲酸作为一种内源性代谢物，可能具有较好的生物相容性。本研究为将其开发为一种新型的索拉非尼增敏剂或辅助治疗药物，用于改善晚期肝癌患者的治疗应答和预后，提供了坚实的临床前实验依据和理论基础，指明了进一步转化研究的方向。
研究亮点