学术研究报告：基于CE-SELEX技术筛选靶向甲胎蛋白的新型ssDNA适配体

一、研究团队与发表信息
本研究由复旦大学附属中山医院肝癌研究所的Dong Lili、Tan Qiwen等共同完成，合作单位包括上海交通大学生命科学技术学院、中南大学癌症研究所等。论文于2015年10月26日发表在*Scientific Reports*（5卷，15552期），标题为《Screening and identifying a novel ssDNA aptamer against alpha-fetoprotein using CE-SELEX》。

二、学术背景与研究目标
甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein, AFP）是肝细胞癌（HCC）的重要血清标志物，临床检测主要依赖抗体技术，但抗体存在制备复杂、稳定性差、细胞渗透性低等缺陷。适配体（Aptamer）是通过指数富集配体系统进化技术（SELEX）筛选的单链DNA或RNA分子，具有高亲和力、易修饰、低免疫原性等优势。本研究旨在通过毛细管电泳-SELEX（CE-SELEX）技术筛选特异性靶向AFP的ssDNA适配体，探索其在肝癌诊断和治疗中的应用潜力。

三、研究流程与方法
1. CE-SELEX筛选
- 初始文库设计：合成含35个随机核苷酸的75-mer ssDNA文库（约10^15种序列）。
- 毛细管电泳分离：使用聚乙二醇醇涂层毛细管（40 cm×50 μm），在-8 kV电压下分离AFP-ssDNA复合物与游离ssDNA，收集结合峰（7-8分钟洗脱组分）。
- PCR扩增与纯化：通过生物素标记的引物扩增结合片段，链霉亲和素磁珠纯化ssDNA子文库。共进行4轮筛选，逐步降低AFP与ssDNA比例（从1:1至1:9）。

1. 克隆与测序

   • 第4轮筛选产物克隆至PMD19-T载体，转化Trans5α感受态细胞，获得83条独特序列。通过DNAMAN软件分析二级结构，选取8种代表性结构（如AP273、AP211）进行验证。
     

2. 亲和力验证与功能研究

   • CE-LIF检测：荧光标记适配体（如FAM-AP273）与AFP混合，通过激光诱导荧光检测结合能力。AP273的平衡解离常数（Kd）为0.5 μM，显著优于其他候选（如AP244的Kd=4.8 μM）。
     
   • 免疫荧光成像：在AFP阳性细胞（HepG2）中，FAM-AP273显示特异性结合，而AFP阴性细胞（A549）无信号，对比抗体染色结果更均匀且灵敏。
     
   • 细胞迁移与侵袭抑制：转染AP273（100 nM）后，HepG2和SMMC7721细胞的迁移和侵袭能力显著降低（Transwell实验），A549细胞无变化。
     

3. 结构与结合模式预测

   • Motif分析：通过MEME工具发现AP273含保守序列“g[g/c][t/a]c[c/t]t[g/a][a/t]”，形成稳定螺旋结构；而阴性对照AP211仅含松散短序列。
     
   • 分子对接模拟：使用iFoldRNA和ZDOCK预测AP273-1片段与AFP的相互作用，关键碱基（如DC9、DA19）参与结合。
     

四、主要研究结果
1. 高效筛选技术：CE-SELEX仅需4轮筛选即获得高亲和力适配体，较传统微流控芯片或琼脂糖珠方法更快速、分辨率更高。
2. 特异性适配体AP273：其Kd为0.5 μM，在后续微孔板实验中进一步验证实际Kd达17.41 nM，与已报道适配体（如AP-Taiwan）相当。
3. 功能验证：AP273不仅可用于AFP的体外检测，还能抑制HCC细胞的迁移和侵袭，提示其治疗潜力。
4. 结构基础：AP273的稳定二级结构（如双臂环）和保守motif是靶向结合的关键。

五、结论与价值
本研究首次通过CE-SELEX技术筛选出AFP特异性适配体AP273，其兼具诊断和治疗潜力：
- 科学价值：证实CE-SELEX在复杂蛋白靶标筛选中的高效性，为适配体设计提供结构学依据。
- 应用价值：AP273可作为肝癌影像探针或靶向治疗载体，克服抗体技术的局限性。

六、研究亮点
1. 技术创新：CE-SELEX结合毛细管电泳的高分辨率与SELEX的高通量，显著提升筛选效率。
2. 多学科交叉：整合分子生物学、结构预测（iFoldRNA）和功能实验，系统性验证适配体性能。
3. 转化潜力：AP273的抑制效应为肝癌治疗提供新策略，尤其适用于AFP高表达患者。

七、其他发现
研究发现不同适配体（如AP250）虽能结合AFP但无功能效应，提示结合域与功能域的分离，未来需通过结构优化增强治疗特性。