一项发表于《自然-生物医学工程》（Nature Biomedical Engineering）的研究提出了一类全新的天然纳米囊泡——小细胞内囊泡（small intracellular vesicles, sIVs），其在产量、稳定性、细胞摄取及治疗递送方面，均显著优于当前研究广泛的小细胞外囊泡（small extracellular vesicles, sEVs）。该研究由天津医科大学眼科医院及眼视光学院的张晓敏及李晓荣团队完成，论文于2025年在线发表。

研究背景

小细胞外囊泡（sEVs），尤其是外泌体，是一类直径30–150纳米、起源于细胞内多囊泡体的分泌型囊泡。它们通过携带蛋白质、RNA和脂质等生物活性分子介导细胞间通讯，在疾病诊断和治疗领域备受关注。然而，sEVs的临床转化面临产量低、稳定性差、治疗功效不足等瓶颈。为此，学界已探索了多种替代方案，如通过挤出红细胞膜或反复冻融循环制备的人工囊泡。但是，这些工程化改造可能会改变囊泡的天然生物学功能，使其有效性降低。

在细胞内部，存在大量天然纳米级囊泡，它们从内质网、高尔基体、细胞膜和内体等细胞器出芽产生，介导胞内物质运输，是细胞生理活动的关键组分。然而，这些胞内囊泡（intracellular vesicles）的分离方法和生物医学应用潜力此前从未被探索。基于此，该研究团队假设，这些细胞内天然存在的囊泡可能具有独特的分子特征和治疗优势，并由此开展了一项系统性的比较研究，旨在开发从多种细胞类型中分离sIVs的方法，解析其分子图谱和功能特征，并评估其在视网膜神经保护中的应用潜力。

研究流程与方法

研究团队建立了一套从间充质干细胞（MSCs）、293T细胞和海拉（HeLa）细胞中分离sIVs的标准化流程。与收集sEVs需48小时分泌期和190分钟差速离心相比，sIVs的获取仅需30秒超声处理和110分钟离心，耗时缩短58%。sIVs被定义为直径30–100纳米、具有天然脂双层膜、表达跨膜蛋白214（TMEM214）的内源性纳米囊泡。 为系统比较sIVs与sEVs的差异，研究分为五个核心环节： 1. 物理与分子特征比较：通过透射电镜、冷冻电镜、纳米颗粒追踪分析和蛋白质印迹法，比较两种囊泡形态、粒径、产量及标志物。研究发现sIVs不表达典型外泌体标志物（如CD63、TSG101），而TMEM214被鉴定为sIVs的标志物。通过超分辨显微镜和活细胞动态成像，证实TMEM214阳性sIVs在胞内密集分布但不分泌到胞外。采用布雷菲德菌素A（BFA）阻断囊泡运输，可破坏sIVs结构并降低其数量，证明sIVs是参与胞内运输的天然囊泡池。 2. 多组学分子图谱分析：进行了无标记蛋白质组学、小RNA测序和非靶向脂质组学分析。蛋白质组学显示，sIVs富含内质网、高尔基体、网格蛋白家族（clathrin protein family）等细胞器相关蛋白，而sEVs富含细胞膜和经典外泌体蛋白。基因本体富集分析表明，sIVs共有的106个独特蛋白主要参与“COPII介导的内质网至高尔基体运输”等胞内转运过程和“ER应激反应”。小RNA测序揭示，microRNA（miRNA）是sIVs中的主要小RNA种类（在MSC-sIVs中占比超92%），其靶基因与胞内代谢、膜性细胞器定位相关；而sEVs中富含Y RNA。脂质组学发现，sIVs中磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine, PC）和磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine, PE）等甘油磷脂水平显著高于sEVs，可能与其内质网起源及增强药物递送有关。 3. 体外细胞摄取与体内递送评估：在体外，采用视网膜色素上皮细胞和人视网膜微血管内皮细胞共培养模型，发现MSC-sIVs在12–48小时的摄取效率显著高于MSC-sEVs。在体内，通过结膜下和玻璃体腔注射，发现MSC-sIVs比MSC-sEVs能更快速、更深入地穿透并弥散至视网膜各层。 4. 视网膜疾病治疗效果比较：分别在蓝光诱导的视网膜损伤小鼠和视网膜色素变性rd10小鼠两种模型中，通过玻璃体腔注射等剂量的MSC-sIVs和MSC-sEVs，比较治疗效果。通过光学相干断层扫描测量视网膜厚度、苏木精-伊红染色统计外核层细胞核数量、视网膜电图评估视觉功能、以及TUNEL染色检测细胞凋亡。 5. 治疗机制与载药应用探索：通过RNA测序、基因集变异分析和蛋白质印迹法，探究囊泡治疗机制，重点分析ER应激通路相关蛋白（如GRP78、CHOP）。此外，比较了两种囊泡装载疏水性药物雷帕霉素（rapamycin, Rapa）的能力及其在光损伤模型中的协同治疗效果。

主要结果

在表征方面，研究证实sIVs产量是sEVs的20–40倍，蛋白总量高5–10倍，且在37°C生理温度下形态和数量保持稳定，而sEVs在此温度下24小时即显著受损。活细胞成像动态追踪到CD63标记的sEVs被分泌到胞外，而TMEM214标记的sIVs仅在胞内移动，排除了其为细胞膜重组产物的可能。

在分子层面，蛋白质组学PCA图显示二者蛋白分布谱截然不同。sIVs显著上调网格蛋白家族和内质网/高尔基体相关蛋白，基因注释富集于“运输囊泡”（transport vesicle）和“内质网应激反应”（response to endoplasmic reticulum stress）。脂质组学显示，MSC-sIVs中磷脂酰胆碱相对丰度差异最大，293T细胞中为磷脂酰乙醇胺，这些成分利于提升膜融合效率和载药能力。

在功能验证上，光损伤模型中，高剂量MSC-sIVs对视网膜变薄和外核层细胞核丢失的挽救效果显著优于同剂量MSC-sEVs。ERG结果显示，MSC-sIVs部分恢复了受损的a波和b波振幅，效果优于MSC-sEVs。MSC-sIVs治疗组的视紫红质表达保留、凋亡细胞（TUNEL阳性）减少均更显著，且更有效地抑制了反应性胶质增生标志物GFAP和Iba1的表达。在rd10小鼠模型中，P28时接受MSC-sIVs治疗的视网膜外核层细胞核数量保留更多，同步的ERG波形挽救也更显著，尤其在最适刺激强度下的a波和b波振幅恢复强于sEVs组。两组治疗均能减少凋亡，但MSC-sIVs对促凋亡蛋白Bax、活化Caspase-3的抑制和抗凋亡蛋白Bcl-2的上调作用更强。 机制研究揭示，抑制ER应激是MSC-sIVs发挥神经保护作用的核心通路。光损伤和rd10模型中，视网膜RNA测序表明MSC-sIVs治疗后“IRE1α激活伴侣蛋白”和“未折叠蛋白反应”通路发生显著变化。蛋白质印迹证实，在两种模型鼠中，MSC-sIVs均能显著下调GRP78、p-PERK、IRE1α、ATF6、CHOP等ER应激标志蛋白，而MSC-sEVs作用微弱。同时，MSC-sIVs比MSC-sEVs载有更高水平的碱性成纤维生长因子（bFGF）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、表皮生长因子（EGF）和白介素-10（IL-10）等神经保护与抗炎因子。 在载药与递送方面，MSC-sIVs对雷帕霉素的包封率和载药率均极高。体内实验显示，结膜下注射后48小时至5天，视网膜吸收sIVs递送的雷帕霉素量远超sEVs。在确保给药囊泡携带等量雷帕霉素的药效学实验中，装载雷帕霉素的sIVs在挽救视网膜厚度、恢复ERG功能、减轻光感受器细胞凋亡方面均显著优于装载雷帕霉素的sEVs和游离药物。蛋白质印迹证实，这一优越疗效通过更有效抑制mTOR信号通路实现。

结论与应用价值

该研究首次成功分离并系统鉴定了细胞内天然纳米囊泡——sIVs。研究表明，与作为“金标准”的sEVs相比，sIVs具有尺寸更小、产量极高、生理温度下稳定性好、胞内和视网膜组织穿透力强、富含磷脂和神经保护因子、以及强大的疏水药物装载能力等多重优势。这一发现为纳米药物递送和再生医学领域提供了全新的、极具转化潜力的天然生物载体。尤其sIVs通过靶向抑制内质网应激来挽救视网膜结构和功能，为视网膜退行性疾病的治疗开辟了新策略。

研究亮点

该研究的创新性主要体现在三个方面：其一，首次定义并分离出细胞内囊泡sIVs，区别于外泌体前体或细胞裂解碎片，为天然纳米囊泡领域增加了全新种类。其二，建立了从“分离-多组学分子特征-体外/体内功能验证-机制解析-药物递送应用”的完整研究范式，逻辑链条严密。其三，发现sIVs的独特生物学基础（富含细胞器运输蛋白和高水平甘油磷脂）决定了其显著优于传统外泌体的药物递送和神经保护功能，尤其是其强力调控内质网应激的能力，在动物模型中展现了明确的治疗效果。该研究不仅基础发现意义重大，其简化制备和高产率等特征也让其临床及工业转化前景十分光明。