本研究由来自江西中医药大学的王东旭、王琪、陈仁浩、杨森林、李志锋（通讯作者）以及江西中医药大学/创新药物与高效节能制药设备国家重点实验室的冯育林（通讯作者）共同完成。研究论文《Exploring the effects of Gastrodia elata Blume on the treatment of cerebral ischemia-reperfusion injury using UPLC-Q/TOF-MS-based plasma metabolomics》于2019年发表在学术期刊《Food & Function》上。
一、 学术背景
本研究的核心科学领域为中药药理学与代谢组学，具体聚焦于脑血管疾病的治疗机制研究。缺血性脑卒中（Ischemic stroke）是全球范围内致残和致死的主要原因之一，约占所有卒中病例的87%。目前，静脉注射组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）是临床一线溶栓疗法，但其存在治疗时间窗严格、可能引起出血转化及神经毒性等副作用，且无法逆转缺血导致的神经细胞死亡。因此，寻找新的、更有效的治疗干预手段是迫切需求。
天麻（Gastrodia elata Blume, GEB）作为一种传统中药和功能性食品，在古籍《本草衍义》中已有记载，常用于治疗惊厥、眩晕、头痛、偏瘫、肢体麻木及风湿性关节炎。现代研究表明，天麻具有扩张脑血管、改善微循环、抑制一氧化氮（NO）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）释放、保护血脑屏障、抵抗氧化应激和炎症损伤、抑制细胞凋亡和自噬等作用，对缺血性疾病显示出良好的治疗前景。然而，天麻治疗脑缺血再灌注损伤的具体分子机制，尤其是其对内源性代谢网络的整体调控作用，尚不完全清楚。
脑缺血再灌注损伤是缺血性脑血管疾病的主要病理过程，涉及自由基损伤、钙超载、氨基酸代谢紊乱、炎症反应和细胞凋亡等一系列复杂事件。代谢组学作为一种系统生物学方法，能够通过分析生物体内小分子代谢物的整体变化，将基因型与表型联系起来，识别疾病相关的生物标志物，从而在分子水平上深入理解疾病进程和治疗机制。基于此，本研究旨在结合药效学评价和基于UPLC-Q/TOF-MS的血浆代谢组学技术，全面探究天麻提取物对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其潜在的作用机制。
二、 详细研究流程
本研究设计严谨，流程主要包括动物模型建立、药效学评价、生化指标检测、组织病理学分析以及血浆代谢组学分析等多个环节。
1. 天麻提取物制备与动物分组： 研究首先从黑龙江省采集天麻药材，经鉴定后，取干燥根茎500克，粉碎，用70%乙醇回流提取三次，合并提取液，过滤，真空浓缩后冻干，得到天麻提取物。实验前用羧甲基纤维素钠水溶液将其配制成200 mg/kg的混悬液备用。 实验动物为成年雄性Wistar大鼠（260±20 g），随机分为4组，每组10只：（1）假手术组（Sham）：仅进行手术操作但不插入线栓；（2）模型组（IR）：大脑中动脉闭塞（MCAO）模型+0.9%生理盐水灌胃；（3）天麻治疗组（GEB）：MCAO模型+天麻提取物（200 mg/kg）灌胃；（4）阳性对照组（Nimodipine）：MCAO模型+尼莫地平（15 mg/kg）灌胃。所有大鼠均每日灌胃给药一次，连续15天。
2. 脑缺血再灌注损伤模型建立： 在末次给药2小时后，采用Zea Longa法建立大鼠右侧大脑中动脉闭塞（MCAO）模型。简单来说，大鼠麻醉后，分离右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，将一根直径约0.32 mm的尼龙线栓从颈总动脉切口插入至颈内动脉，阻塞大脑中动脉起始部，造成大脑中动脉供血区缺血。2小时后，将线栓拔出约15 mm，实现血流再灌注。假手术组仅分离血管，不插入线栓。
3. 药效学与生化指标评估： 再灌注24小时后，首先对大鼠进行神经行为学评分（0-4分，评分越高神经功能缺损越严重）。随后处死大鼠，取脑。将脑组织冠状切片，用2% 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色，正常组织染为红色，梗死区域为白色，利用图像分析软件计算脑梗死体积百分比。 接着，取部分脑组织进行生化指标检测。将脑组织匀浆离心后，取上清液，使用商品化试剂盒测定超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性以及丙二醛（MDA）的含量，以评估氧化应激水平。同时，采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定脑组织中白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-10（IL-10）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的含量，以评估炎症反应水平。
4. 组织病理学分析： 取另一部分脑组织，经心脏灌注固定后，石蜡包埋切片，进行苏木精-伊红（H&E）染色，在光镜下观察顶叶皮层神经元形态、水肿、核固缩、神经胶质增生等病理变化。同时，使用TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记）染色试剂盒检测细胞凋亡情况，荧光显微镜下观察凋亡细胞（绿色荧光），并计算凋亡细胞百分比。
5. 血浆代谢组学分析： 这是本研究的核心创新部分。在再灌注24小时后，收集假手术组、模型组和天麻治疗组大鼠的血浆样本。样本前处理采用甲醇（含内标2-氯-L-苯丙氨酸）沉淀蛋白，离心过滤后进样分析。 分析平台： 采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术。色谱系统为岛津UPLC，质谱仪为AB Sciex TripleTOF® 5600。色谱柱为Acquity UPLC C18柱，流动相为0.1%甲酸水溶液和乙腈，进行梯度洗脱。 数据采集： 采用信息依赖性采集（Information-Dependent Acquisition, IDA）模式，同时进行一级全扫描和二级碎裂扫描。每5个样本进行一次质量校准以保证数据稳定性。同时穿插分析6个质控（QC）样本以监控系统稳定性。 数据处理与分析： 原始数据经MarkerView软件转换为“m/z”格式，并用内标进行归一化。首先进行数据筛选：保留在任何一组中检出率为100%且QC样本中相对标准偏差（RSD）<30%的特征峰。缺失值用该特征峰丰度最小值的一半填充。随后进行多元统计分析：采用主成分分析（PCA）评估QC样本的聚集性和整体数据质量；采用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型区分组间差异。通过200次随机排列检验验证模型的有效性，防止过拟合。筛选OPLS-DA模型中变量重要性投影（VIP）值>1且t检验p值<0.05的差异代谢物。将这些代谢物的精确质量数和二级质谱碎片信息与人类代谢组数据库（HMDB）进行比对，进行鉴定。最后，利用MetaboAnalyst 4.0等工具对鉴定出的差异代谢物进行代谢通路富集分析，并通过与标准品比对确认关键潜在生物标志物。
三、 主要研究结果
1. 天麻改善神经功能缺损和脑梗死： 神经行为学评分显示，模型组评分显著高于假手术组。天麻治疗组和尼莫地平组的评分均显著低于模型组。TTC染色结果与此一致：模型组出现明显的白色梗死区域，而天麻治疗组和尼莫地平组的梗死面积显著减小。这表明天麻提取物能有效改善脑缺血再灌注引起的神经功能缺损并减少脑梗死体积。
2. 天麻减轻神经元损伤和细胞凋亡： H&E染色显示，模型组顶叶皮层神经元排列松散、水肿明显，出现核固缩、神经细胞萎缩、周围脱髓鞘、神经元变性和小胶质细胞增生等病理改变。天麻治疗组和尼莫地平组这些病变均得到显著改善。TUNEL染色结果显示，模型组顶叶皮层存在大量凋亡细胞（绿色荧光），而天麻治疗能显著降低凋亡细胞百分比。这表明天麻具有保护神经元、抑制细胞凋亡的作用。
3. 天麻调节氧化应激和炎症反应： 生化指标结果显示，与假手术组相比，模型组脑组织中氧化损伤产物MDA含量显著升高，而抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性显著降低。天麻治疗显著降低了MDA水平，并提高了SOD和GSH-Px的活性。在炎症因子方面，模型组促炎因子IL-1β和TNF-α水平显著升高，而抗炎因子IL-10水平显著下降。天麻治疗能有效抑制IL-1β和TNF-α的升高，并提升IL-10的水平。这些结果从生化和分子层面证实，天麻通过增强内源性抗氧化防御系统和调节炎症因子网络，发挥对脑缺血再灌注损伤的保护作用。
4. 代谢组学揭示天麻调控的关键代谢物与通路： 基于UPLC-Q/TOF-MS的代谢组学分析共鉴定出43个与天麻治疗相关的血浆差异代谢物。通过进一步筛选和验证，最终确定了6个在模型组和天麻治疗组间存在显著差异（p < 0.05）的潜在生物标志物： * 花生四烯酸（Arachidonic acid）： 在模型组中水平显著低于假手术组，而天麻治疗后其水平显著回升。 * L-组氨酸（L-Histidine）、鞘氨醇（Sphinganine）、胸腺嘧啶（Thymine）、亚精胺（Spermidine）、脱氧胞苷（Deoxycytidine）： 这5种代谢物在模型组中水平显著高于假手术组，而在天麻治疗后其水平均显著下降。
代谢通路富集分析 表明，这些差异代谢物主要涉及以下六条代谢途径：花生四烯酸代谢、组氨酸代谢、嘧啶代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、鞘脂代谢以及甘油磷脂代谢。研究结果揭示了天麻治疗脑缺血再灌注损伤的新机制：它不仅通过已知的抗炎、抗氧化、抗神经毒性和抗凋亡途径发挥作用，还通过系统性地调节上述多条内源性代谢通路来恢复机体的代谢稳态。
四、 研究结论与价值
本研究通过整合经典药效学评价和先进的血浆代谢组学技术，系统阐明了天麻提取物对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其多靶点、多通路的作用机制。 科学价值： 1. 机制创新： 研究首次从整体代谢调控的角度，揭示了天麻治疗脑缺血再灌注损伤涉及花生四烯酸代谢、组氨酸代谢、嘧啶代谢、鞘脂代谢等新的代谢通路，超越了以往主要关注抗炎、抗氧化等单一途径的认识，为理解中药多成分、多靶点、整体调节的特点提供了代谢层面的证据。 2. 生物标志物发现： 鉴定出花生四烯酸、L-组氨酸、鞘氨醇、胸腺嘧啶、亚精胺和脱氧胞苷这6个与天麻疗效密切相关的潜在血浆生物标志物。这些标志物为缺血性疾病的诊断、疗效监测以及新药研发提供了新的候选分子。 3. 方法学应用： 成功地将UPLC-Q/TOF-MS结合IDA采集模式的代谢组学策略应用于中药复杂体系的作用机制研究，展示了该技术在揭示中药整体药效物质基础和作用网络方面的强大能力。
应用价值： 1. 为天麻的临床应用提供更深入的药理学依据： 研究结果从代谢层面强化了天麻治疗脑血管疾病的科学基础，支持其作为治疗缺血性脑卒中的潜在辅助或替代药物/功能性食品进行进一步开发。 2. 为中药现代化研究提供范式： 本研究展示了如何将现代系统生物学方法（代谢组学）与传统中药药效评价相结合，为其他中药的作用机制研究提供了可借鉴的技术路线和研究思路。 3. 为新药研发指明方向： 发现的关键代谢通路和生物标志物，可作为筛选和评价抗脑缺血药物的新靶点和新指标。
五、 研究亮点
本研究是一项设计严谨、技术先进、结论创新的综合性研究，不仅深化了对天麻这一传统中药治疗脑缺血损伤科学内涵的认识，也为利用代谢组学技术推动中药现代化研究提供了优秀范例。