本研究由武文静、朱思源、桑星洁、张琴、赵鹏、张海龙、白云苹（通讯作者）共同完成，作者单位主要为河南中医药大学呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心、河南省中医药防治呼吸病重点实验室以及河南中医药大学第一附属医院呼吸科。该研究以学术论文形式发表于《中国病理生理杂志》（Chinese Journal of Pathophysiology）2025年第41卷第4期。
本研究的学术背景聚焦于呼吸系统疾病研究领域，具体针对特发性肺纤维化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF）的严重临床事件——急性加重期（Acute Exacerbation of IPF, AE-IPF）。IPF是一种病因不明、慢性进展性且预后极差的疾病，患者中位生存期仅为3至5年。其中，约13%-20%的患者会在病程中出现急性加重，表现为短期内呼吸功能急剧恶化，胸部影像学出现新发的双肺弥漫性磨玻璃影和/或实变影。AE-IPF的住院死亡率高达55%-80%，中位生存期仅3-4个月，但目前临床缺乏疗效确切的治疗方法。其根本原因在于对AE-IPF的确切发病机制了解尚不完全，而这又受限于能够精确模拟人类AE-IPF临床与病理特征的动物模型的缺乏。现有的AE-IPF造模方法（如病毒、细菌、高氧、百草枯、脂多糖联合博来霉素等）存在成本高、操作复杂、需特殊实验室条件或模型稳定性不足等问题。而传统的单次博来霉素气管滴注肺纤维化模型，虽应用广泛，但难以模拟IPF的慢性进展和不可逆性，且因小鼠自愈能力强，纤维化病变可能随时间消退，无法为在稳定纤维化基础上叠加急性损伤的AE-IPF研究提供理想基础。因此，本研究旨在建立一种操作相对简便、稳定可靠且能较好模拟临床AE-IPF特征的动物模型，为深入探究其发病机制和筛选评价潜在治疗药物提供关键工具。具体研究目标是，在前期已建立的稳定IPF小鼠模型基础上，通过再次施加高剂量损伤，成功构建AE-IPF小鼠模型，并进行全面系统的评价，以确定模型的有效性及最佳观察时间点。
本研究的详细工作流程包含多个严谨的环节。首先，在动物模型构建与分组阶段，研究使用了120只清洁级雄性C57BL/6小鼠，随机分为三组：阴性对照组、肺间质纤维化稳定期组和肺间质纤维化急性加重期组，每组40只。模型诱导采用多次气管滴注博来霉素的方案。IPF组小鼠于实验第0、14、28天经气管滴注低剂量博来霉素；AE-IPF组则在IPF组诱导方案的基础上，于第56天追加滴注一次高剂量博来霉素；对照组则在相应时间点滴注等体积生理盐水。整个实验周期为70天，并计划于第57、59、63和70天这四个时间点分批处死动物取材，以动态观察疾病进展。其次，在观察与样本采集阶段，研究每日观察小鼠的一般生存状态，每3天记录一次体重。在每个预定取材时间点，对小鼠进行麻醉后，先进行活体小动物肺功能检测，测量呼吸频率、每分钟通气量和吸气时间等参数。随后处死小鼠，采集样本。打开胸腔后，完整剥离肺组织，称取肺湿重并拍照，计算肺指数。通过气管进行支气管肺泡灌洗，收集灌洗液用于后续细胞总数计数和白细胞介素-6含量检测。同时，分离左右肺，右肺冻存用于生化分析，左肺则用多聚甲醛灌注固定用于后续病理学检查。此外，在部分时间点还对活体小鼠进行了微型CT扫描，以无创方式观察肺部影像学变化。第三，在病理与分子生物学检测阶段，对固定的左肺组织进行石蜡包埋、切片，分别进行苏木精-伊红染色和Masson三色染色。HE染色用于观察肺组织结构破坏、炎症细胞浸润等情况，并根据Szapiel标准进行肺泡炎评分；Masson染色则特异性显示胶原纤维沉积，采用Ashcroft评分系统对肺纤维化程度进行半定量评估。利用碱水解法检测冻存肺组织中的羟脯氨酸含量，该指标是胶原蛋白特有的氨基酸成分，其含量可间接反映肺组织总胶原沉积即纤维化的程度。采用酶联免疫吸附测定法检测支气管肺泡灌洗液上清中促炎细胞因子IL-6的质量浓度。使用全自动血细胞分析仪对支气管肺泡灌洗液中的细胞沉淀进行细胞总数计数。第四，在数据分析阶段，所有计量数据以均数±标准差表示，使用GraphPad Prism 8.0.1软件进行统计分析。对于符合正态分布的数据，采用t检验进行两组间比较，以P<0.05作为差异具有统计学意义的判断标准。
本研究取得了一系列系统性的结果，清晰地描绘了AE-IPF模型的特征。在一般情况与生存分析方面，AE-IPF组小鼠在急性加重干预后，表现出明显的临床症状恶化，如喘息、气促、呼吸困难和体重显著下降。体重监测数据显示，在基础IPF建模期，IPF组和AE-IPF组小鼠体重均显著低于对照组；而在第56天给予高剂量博来霉素后，AE-IPF组小鼠体重在第57至70天期间显著低于IPF组，表明急性加重损伤导致了进一步的消耗。在肺功能检测结果中，与对照组相比，IPF组和AE-IPF组的每分钟通气量均显著下降；重要的是，在急性加重后的早期时间点，AE-IPF组的每分钟通气量下降程度比IPF组更为严重，直接反映了模型小鼠呼吸功能在稳定纤维化基础上的急性恶化。在影像学评估方面，微型CT结果提供了直观证据。IPF组小鼠肺部呈现典型的稳定期纤维化改变，如斑片状阴影、胸膜下网状影、小叶间隔增厚、小叶内线状影以及牵拉性支气管扩张。而AE-IPF组小鼠在具备上述IPF特征的同时，出现了新发的磨玻璃阴影和实变影，这与临床诊断AE-IPF的核心影像学标准高度吻合。在肺大体形态与肺指数方面，AE-IPF组小鼠肺组织外观充血、瘀斑、质地变硬等病变比IPF组更明显。肺指数分析显示，AE-IPF组在急性加重后的多个时间点，其肺指数均显著高于IPF组，提示存在急性肺水肿和炎症渗出。在病理组织学这一金标准层面，HE染色显示AE-IPF组肺组织肺泡结构破坏严重，肺泡壁显著增厚，肺泡腔内和间质有大量炎症细胞浸润，其肺泡炎评分显著高于IPF组。Masson染色则清晰显示AE-IPF组肺间质中蓝色胶原纤维沉积范围更广、密度更高，纤维化评分在多个时间点显著高于IPF组。这些病理变化共同构成了弥漫性肺泡损伤叠加于普通型间质性肺炎背景之上的AE-IPF典型病理表现。在生化与分子标志物检测方面，肺组织羟脯氨酸含量检测证实，AE-IPF组肺内胶原含量在多个时间点高于IPF组，从生化角度印证了纤维化的急性进展。支气管肺泡灌洗液分析显示，AE-IPF组灌洗液中的总细胞数以及促炎因子IL-6的水平均显著高于IPF组，表明急性加重期伴有显著的炎症细胞募集和炎症反应加剧。以上结果层层递进：临床症状和体重变化提示了疾病的严重性；肺功能数据量化了呼吸功能障碍；CT影像提供了无创的结构性证据；肺指数反映了急性肺损伤的渗出性改变；病理染色直观确认了肺泡炎和纤维化的形态学特征；而生化指标则从分子和细胞水平揭示了胶原代谢异常和炎症激活。所有这些结果相互支撑，共同指向一个结论：该建模方法成功地在稳定期IPF的基础上，诱导出了符合临床定义的AE-IPF表型。
基于上述全面的结果，本研究得出的核心结论是：采用不同剂量、多次气管滴注博来霉素的方法，能够成功建立稳定且符合临床病理特征的AE-IPF小鼠动物模型。特别是，在实验第63天（即急性加重干预后第7天），模型的各项病理特征和临床表现最为显著，被确定为研究该模型的最佳观察时间点。该模型的成功建立，为深入研究AE-IPF复杂的发病机制，以及系统评估抗纤维化、抗炎等潜在治疗策略的药效，提供了一个可靠、有效的实验平台。
本研究的价值与意义体现在多个层面。在科学价值上，它填补了现有AE-IPF动物模型在简便性、稳定性和临床贴合度方面的不足，为疾病机理研究提供了关键工具。通过该模型揭示的急性加重期特征，如炎症爆发、胶原沉积加速、肺功能急性下降等，有助于科学家们解析从稳定纤维化向急性加重转变的关键分子事件和信号通路。在应用价值上，该模型标准化了AE-IPF的研究条件，能够用于高通量筛选和验证针对AE-IPF的新型药物，加速临床前转化研究，对未来开发出能够预防或治疗AE-IPF的有效疗法具有重要的推动作用。
本研究的亮点突出。首先，在建模方法上具有创新性，采用了“低剂量多次诱导稳定期+单次高剂量触发急性期”的分阶段策略，巧妙地模拟了临床AE-IPF是在慢性IPF基础上急性发作的疾病进程，比单一损伤模型更具生理和病理相关性。其次，研究目标明确且具有高度临床需求导向，直接针对死亡率高、治疗手段匮乏的临床难题展开基础工具开发。第三，评价体系极为全面系统，并非依赖单一指标，而是整合了行为学、影像学、生理功能、病理形态、生化分子等多维度、多时间点的动态评估，形成了一个严谨的证据链，极大地增强了模型可信度和评价的说服力。这种综合评价体系本身也为后续相关动物模型研究提供了范本。此外，研究明确提出了模型的最佳观察时间点，这对未来使用该模型的研究者具有直接的指导意义，有助于提高实验的一致性和可重复性。