本研究由来自北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室、北京大学第一医院等多机构的研究人员共同完成，刘晓军（Xiaojiao Sun）、张俊玲（Junling Zhang）、董冰琪（Bingqi Dong）及熊青青（Qingqing Xiong）为共同第一作者，刘振明（Zhenming Liu）、庞晓聪（Xiaocong Pang）及崔一民（Yimin Cui）为共同通讯作者。该研究成果于2024年11月5日在线发表于Advanced Science期刊，论文标题为“Targeting SLITRK4 Restrains Proliferation and Liver Metastasis in Colorectal Cancer via Regulating PI3K/AKT/NF-κB Pathway and Tumor-Associated Macrophage”。
结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是全球第三大常见恶性肿瘤（占比10%）及第二大癌症相关死亡原因（占比9.4%）。超过半数的结直肠癌患者在疾病进展过程中最终会发生肝转移，而肝转移是导致结直肠癌患者死亡的主要原因。对于局限性肿瘤患者，术后五年生存率可超过90%，然而一旦发生肝转移，若无法进行根治性切除，五年生存率仅为9%。因此，深入探索结直肠癌肝转移的分子机制并寻找新型治疗靶点，对于改善患者总生存期具有迫切的临床意义。
既往研究表明，神经营养性酪氨酸受体激酶（NTRK）基因家族在神经系统发育和肿瘤发生中具有双重功能。NTRK融合突变在多种肿瘤中被发现，可通过持续激活下游MAPK、PI3K及PKC信号通路，促进肿瘤细胞增殖与分化。SLITRK家族是一类含有富亮氨酸重复序列（Leucine-Rich Repeat, LRR）结构域的跨膜蛋白，其胞外区结构与NTRK相似。既往对SLITRK家族的研究主要集中于其在神经系统疾病中的功能，而其在肿瘤微环境中的作用尚不明确。本研究旨在系统鉴定结直肠癌肝转移的新型驱动因子，并探索其作为治疗靶点的潜力。
本研究采用多层次、多模型的实验策略，系统揭示了SLITRK4在结直肠癌肝转移中的功能角色及其分子机制。
（一）临床样本转录组分析及表达验证
研究团队首先对来自8位患者的4例癌旁正常组织、3例原发结直肠癌肿瘤及6例肝转移灶样本进行了RNA测序（RNA-seq）分析。测序结果通过差异表达基因分析，发现SLITRK4是肝转移灶中上调最为显著的基因。随后，研究者在GSE14297公共数据库队列（包含18对配对的原发结直肠癌及其肝转移组织）中验证了SLITRK4的表达水平。利用TCGA-COAD队列数据，通过Kaplan-Meier生存分析和单因素/多因素Cox回归分析评估了SLITRK4的预后价值。在蛋白水平上，研究者对21对配对的原发结直肠癌与肝转移组织进行了免疫组织化学（IHC）染色，采用Allred评分系统进行定量评估。此外，还在五种CRC细胞系（LoVo、Caco2、SW480、SW620、HCT116）及正常黏膜细胞中检测了SLITRK4的mRNA和蛋白表达水平。
（二）体外功能实验
为明确SLITRK4的生物学功能，研究者构建了SLITRK4敲低（SW620细胞）和过表达（SW480细胞）的细胞模型。采用克隆形成实验和CCK-8实验评估细胞增殖能力；通过细胞黏附实验检测细胞与细胞外基质的黏附能力；利用Transwell小室实验（含或不含Matrigel基质胶）分别检测细胞迁移和侵袭能力；通过将CRC细胞的条件培养基与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）共培养，进行体外血管形成（Tube Formation）实验以评估肿瘤血管生成能力；采用Western blot检测上皮-间充质转化（EMT）相关标志物的变化。
（三）转录组测序及机制分析
为阐明SLITRK4发挥促癌功能的下游分子机制，研究者对SLITRK4过表达及对照SW480细胞进行了RNA-seq分析。通过DESeq鉴定差异表达基因，并利用KEGG和GO数据库进行通路富集分析。基于富集结果，研究者进一步通过Western blot验证了PI3K/AKT/NF-κB信号通路关键蛋白的磷酸化水平变化；通过定量PCR（qRT-PCR）检测了细胞外基质（ECM）相关基因、血管生成因子VEGFA以及多种细胞因子的表达水平；采用ELISA法检测了IL-8和VEGFA的分泌水平。利用PI3K抑制剂LY294002和NF-κB抑制剂BAY11-7082进行了通路验证实验。
（四）肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）功能研究
通过TIMER数据库分析SLITRK4表达与免疫细胞浸润的相关性。在体外共培养模型中，将人外周血单核细胞（PBMCs）来源的巨噬细胞或THP-1细胞与CRC细胞（SLITRK4敲低或过表达）的条件培养基共培养，通过Transwell迁移实验评估巨噬细胞的趋化迁移能力；通过qRT-PCR检测巨噬细胞极化标志物（如CD163、IL-10）的变化；利用流式细胞术分析M2型巨噬细胞表面标志物（CD206^high^CD86^low^）的表达比例。采用CCR2抑制剂RS102895、GDF15抗体抑制剂Ponsegromab及CSF-1中和抗体Lacnotuzumab进行阻断实验，以验证特定细胞因子在巨噬细胞招募和极化中的作用。
（五）体内动物模型验证
研究者构建了多种体内动物模型以验证SLITRK4的促癌功能。利用皮下异种移植瘤模型（Balb/c裸鼠）评估SLITRK4对肿瘤生长的影响；通过脾内注射建立肝转移模型，观察SLITRK4对肝转移灶形成的影响。利用氯膦酸脂质体（Clodronate Liposome, L-Clod）在CT26-OVSLITRK4肝转移模型中系统性清除巨噬细胞，以验证TAMs在SLITRK4诱导肝转移中的必要性。此外，对CT26 CRC肝移植瘤进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），以单细胞分辨率解析SLITRK4对肿瘤免疫微环境中巨噬细胞和T细胞亚群组成的全局性影响。
（六）靶向SLITRK4的纳米治疗递送系统开发与验证
鉴于SLITRK4缺乏可供药物直接结合的晶体结构，研究者开发了基于脂质-聚合物杂化纳米颗粒（Lipid-Polymer Hybrid Nanoparticles, NPs）的siRNA全身递送系统。该NPs由mPEG-PLGA共聚物与阳离子脂质样材料G0-C14自组装形成，内部包载靶向SLITRK4的小干扰RNA（siSLITRK4）。通过透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）对NPs的形态、粒径及zeta电位进行表征；利用流式细胞术检测Cy5标记的siSLITRK4-NPs在SW620细胞中的胞内摄取效率；通过CCK-8实验评估siSLITRK4-NPs对CRC细胞活力的影响。在体内药效评估方面，研究者在SW620、HCT116及CT26皮下瘤模型中通过尾静脉注射给予siSLITRK4-NPs治疗，观察记录肿瘤体积和体重变化；在SW620-Luc肝转移模型中通过活体生物发光成像动态监测肝转移瘤的生长变化。最后，利用结直肠癌肝转移患者来源的肿瘤类器官（Patient-Derived Organoid, PDO）建立的异种移植（PDOX）模型，在Hu-NPI人源化小鼠中验证了siSLITRK4-NPs的治疗潜力。
（一）SLITRK4在结直肠癌肝转移中显著高表达且与不良预后相关
内部队列RNA-seq分析揭示，SLITRK4是肝转移灶对比原发肿瘤中上调最显著的基因。在SLITRK 1-6家族成员中，仅SLITRK4在肝转移样本中特异性上调。GSE14297队列验证了配对样本中肝转移组织的SLITRK4表达显著高于原发肿瘤。TCGA-COAD队列生存分析显示，高表达SLITRK4的患者总生存期（OS）和无病生存期（DFS）均显著劣于低表达组。多因素Cox回归和列线图分析表明，SLITRK4可作为结直肠癌患者的独立预后因素。IHC结果证实SLITRK4蛋白在肝转移组织中表达显著高于配对的原发肿瘤。细胞系检测显示，SW620（源自同一患者转移灶）的SLITRK4表达水平高于SW480（源自该患者原发灶），进一步提示SLITRK4与转移潜能的关联。
（二）SLITRK4促进结直肠癌细胞增殖、侵袭、迁移及血管生成
体外功能实验结果表明，敲低SLITRK4可显著抑制SW620细胞的增殖、克隆形成、黏附、迁移及侵袭能力；反之，过表达SLITRK4则显著增强SW480细胞的上述恶性表型。Western blot检测发现，SLITRK4能够调控ZEB介导的EMT过程，影响E-cadherin和Vimentin等标志物的表达。在血管生成实验中，SLITRK4过表达的SW480细胞条件培养基能够显著促进HUVECs的管腔形成，并伴有VEGFA分泌水平的升高。
（三）SLITRK4激活PI3K/AKT/NF-κB信号通路并调控细胞外基质及细胞因子表达
RNA-seq分析鉴定出648个上调基因和1468个下调基因。KEGG富集分析显示，PI3K/AKT信号通路是受SLITRK4调控最为显著的信号通路。Western blot验证表明，SLITRK4过表达显著增强PI3K、AKT及NF-κB的磷酸化水平，而敲低SLITRK4则抑制其磷酸化。GO生物学过程富集分析提示，SLITRK4参与了“细胞外基质组织”、“血管调控”、“血管生成调控”及“细胞因子生成调控”等过程。qRT-PCR和Western blot证实，SLITRK4过表达可显著上调多种ECM基因（如COL1A2、COMP等）的表达。在细胞因子调控方面，SLITRK4过表达显著促进了CCL2、CSF1、GDF15的mRNA表达以及IL-8的分泌。使用PI3K抑制剂和NF-κB抑制剂可有效阻断上述细胞因子的分泌，证实了PI3K/AKT/NF-κB通路在其中的核心介导作用。
（四）SLITRK4通过旁分泌细胞因子诱导肿瘤相关巨噬细胞的招募与M2型极化
TIMER分析显示SLITRK4表达与结直肠癌中巨噬细胞浸润水平呈正相关。体外共培养实验中，SLITRK4过表达的SW480细胞条件培养基能够显著增强PBMCs来源巨噬细胞的迁移能力，而这一效应可被CCR2抑制剂RS102895、GDF15抗体Ponsegromab及CSF-1中和抗体Lacnotuzumab显著抑制，表明CCL2/CCR2、GDF15及CSF-1信号轴参与了SLITRK4介导的巨噬细胞招募。在极化方面，与SLITRK4过表达细胞上清共培养的THP-1细胞中M2型标志物CD163和IL-10的表达显著上调；流式细胞术进一步证实，PBMCs来源巨噬细胞中CD206^high^CD86^low^亚群的比例显著增加。体内实验中，使用氯膦酸脂质体清除巨噬细胞可显著抑制SLITRK4过表达所诱导的肝转移，明确了TAMs在SLITRK4促转移功能中的关键作用。
（五）单细胞测序揭示SLITRK4塑造免疫抑制性肿瘤微环境
scRNA-seq分析结果显示，SLITRK4过表达导致肝转移瘤内免疫细胞组成发生显著重塑。在巨噬细胞亚群中，SLITRK4过表达组中C1QC+ TAMs占比最高，而CCR7+和CCL5+ TAMs比例显著减少；SLITRK4敲低组则呈现相反趋势，且促炎性细胞因子（如CCL9、CCL5）的表达上调。在T细胞亚群方面，SLITRK4敲低显著增加了CD8+ T细胞和NK细胞的比例。Luminex多因子检测验证了SLITRK4过表达可促进血浆中MCP-1、M-CSF、IL-10的产生，同时抑制IL-1、CCL5、MIP-1α、MIP-1β及IL-12等抗肿瘤免疫相关因子的产生，整体营造免疫抑制性微环境。
（六）siSLITRK4-NPs纳米药物有效抑制结直肠癌生长及肝转移
成功制备的siSLITRK4-NPs呈均匀球形结构，水合粒径约141 nm，PDI为0.251。体外摄取实验表明，NPs可高效递送siRNA进入SW620细胞，且细胞摄取量随孵育时间延长而增加。CCK-8实验显示，siSLITRK4-NPs处理48小时后，SW620和HCT116细胞的活力显著低于游离siRNA处理组，而对照NPs则无细胞毒性。在体内实验中，siSLITRK4-NPs在SW620、HCT116及CT26皮下移植瘤模型中均展现出显著的抑瘤效果，且未观察到明显的体重下降等系统性毒性。免疫组化及多色免疫荧光结果显示，siSLITRK4-NPs治疗可下调肿瘤组织SLITRK4表达，抑制增殖标志物Ki-67和血管标志物CD31的表达，同时减少M2型TAMs（CD206^+^CD11b^+^）的浸润，并增加活化的CD8^+^Ki-67^+^ T细胞的丰度。在SW620-Luc肝转移模型中，siSLITRK4-NPs治疗组的生物发光信号显著低于对照组，肝转移灶中Ki-67阳性细胞明显减少。尤为重要的是，在患者来源类器官异种移植（PDOX）模型中，siSLITRK4-NPs同样展现出显著的抗肿瘤效果，为其临床转化提供了有力支持。
本研究首次系统阐明了SLITRK4在结直肠癌增殖和肝转移中的驱动作用及其分子机制。研究证实，SLITRK4通过激活PI3K/AKT/NF-κB信号通路，一方面作用于肿瘤细胞自身，促进细胞增殖、EMT过程和血管生成，并通过上调多种ECM分子增强细胞与基质的相互作用；另一方面，通过旁分泌CCL2、CSF1、GDF15及IL-8等细胞因子，招募并极化肿瘤相关巨噬细胞至M2型免疫抑制表型，协同塑造免疫抑制性肿瘤微环境。该研究不仅丰富了NTRK样家族成员在肿瘤学中的功能认知，更重要的是，由于大多数结直肠癌肝转移患者无法进行根治性切除，依赖转化治疗，而现有靶向药物（如西妥昔单抗）因副作用和耐药性临床获益有限，免疫检查点抑制剂也仅对约5%的微卫星高度不稳定（MSI-H）患者有效。本研究开发的脂质-聚合物杂化纳米颗粒递送siSLITRK4疗法，为结直肠癌肝转移的转化治疗提供了一个全新的、具有良好转化潜力的治疗策略。
本研究具有以下突出亮点：第一，发现并验证了一个全新的结直肠癌肝转移驱动因子SLITRK4，填补了该家族成员在肿瘤微环境研究中的空白；第二，机制研究具有深度和广度，同时阐明了SLITRK4在肿瘤细胞自主性通路（PI3K/AKT/NF-κB）和非自主性通路（TAMs招募与极化）中的双重作用，并通过单细胞测序技术在单细胞水平全景式描绘了SLITRK4对肿瘤免疫微环境的重塑效应；第三，在研究策略上，从临床样本发现、到多模型功能验证、再到机制深度解析，最终落脚于自主研发的纳米药物治疗系统构建及多模型（细胞系来源、PDOX模型）药效验证，形成了“从临床中来，到临床中去”的完整转化研究闭环；第四，所开发的脂质-聚合物杂化纳米递送平台具有优秀的siRNA递送效率和良好的生物相容性，在多个动物模型中展现出强大的抗肿瘤和抗转移效果，为缺乏可药性靶点的SLITRK4提供了切实可行的干预途径，展现了广阔的临床应用前景。