学术研究报告：糖苷酶介导的位点特异性检测氧化应激下基因组中的8-氧代-7,8-二氢鸟嘌呤（8-oxo-7,8-dihydroguanine, 8OG）
一、作者与发表信息
本研究由武汉大学公共卫生学院职业与环境健康系的Ji Tong-Tong、Wang Min、Guo Xia等共同完成，通讯作者为Bi-Feng Yuan、Neng-Bin Xie和Yao-Hua Gu。论文发表于Analytical Chemistry期刊2025年第97卷，页码8564–8573。
二、学术背景
科学领域：本研究属于表观遗传学与DNA损伤修复的交叉领域，聚焦于氧化应激导致的DNA修饰及其检测技术。
研究背景：
8-氧代-7,8-二氢鸟嘌呤（8OG）是活性氧（ROS）攻击鸟嘌呤（G）的主要产物，与衰老、神经退行性疾病和癌症密切相关。传统检测方法（如液相色谱-质谱联用技术，LC-MS/MS）虽可定量8OG，但无法实现基因组位点特异性检测；而高通量测序技术成本高且操作复杂。因此，开发一种高灵敏度、位点特异性的8OG检测方法具有重要科学意义。
研究目标：
开发一种基于糖苷酶切割介导的延伸阻滞（Glycosylase Cleavage-mediated Extension Stalling, GCES）的新方法，实现基因组DNA中8OG的位点特异性定量检测，并应用于氧化应激（如H₂O₂）或环境毒素（如三氯生）诱导的DNA损伤研究。
三、研究流程与实验方法
1. Pab-AGOG糖苷酶的制备与活性验证
- 蛋白表达与纯化：从古菌*Pyrococcus abyssi*中克隆Pab-AGOG基因，构建pET-28a载体并在E. coli BL21(DE3)中表达，通过镍柱纯化获得重组蛋白（27.7 kDa）。
- 酶活性验证：
- 底物设计：合成含8OG的单链DNA（ssDNA-8OG）和双链DNA（dsDNA-8OG/C、dsDNA-8OG/A）。
- 切割实验：Pab-AGOG在pH 8.0缓冲体系中切割8OG的N-糖苷键，生成无碱基位点（AP位点），随后通过AP内切酶1（APE1）完全断裂DNA链。
- 结果：Pab-AGOG对ssDNA和dsDNA中的8OG均具有高效特异性切割能力（图2d-e）。
2. GCES方法的优化
- 切割条件优化：确定最佳反应条件为0.2 μM Pab-AGOG、37℃孵育5分钟，切割效率接近100%。
- 延伸反应优化：使用Bst 3.0 DNA聚合酶，在65℃、10 mM Mg²⁺条件下实现8OG与正常碱基（G）的显著区分（图S3）。
3. 8OG的定量性能验证
- 线性范围：通过混合不同比例的dsDNA-8OG/C与dsDNA-G/C，验证GCES的定量线性（R²=0.988，图3b）。
- 加标实验：在HEK293T细胞基因组DNA中加入已知浓度的8OG-DNA，回收率误差≤10%（表S8）。
4. 氧化应激模型中的应用
- 合成DNA中的8OG检测：H₂O₂处理含G的dsDNA后，GCES检测到8OG水平随时间增加（2小时：28.8%；4小时：69.9%，图4c）。
- 细胞基因组DNA检测：
- H₂O₂处理：在HEK293T、HeLa和HepG2细胞中，TP53基因chr17:7674234位点的8OG水平分别为23.6%、28.0%和36.0%（图5b）。
- 三氯生处理：50 μM三氯生使HepG2细胞中8OG水平升至45.4%（图6b），且伴随ROS生成和OGG1修复酶表达上调（图S7）。
四、主要结果与逻辑关联
- Pab-AGOG的高效切割：验证了该酶对8OG的特异性，为GCES方法奠定基础（图2）。
- GCES的定量能力：通过混合比例实验证明其线性关系，支持后续生物学样本的精准定量（图3）。
- 氧化应激模型的动态监测：H₂O₂和三氯生均显著提升8OG水平，证实GCES可用于环境毒素的DNA损伤评估（图4-6）。
五、研究结论与价值
科学价值：
- 首次将Pab-AGOG糖苷酶应用于位点特异性8OG检测，填补了高分辨率定量技术的空白。
- 揭示了氧化应激与表观遗传标记（8OG）的动态关联，为疾病机制研究提供新工具。
应用价值：
- 环境毒理学：快速评估三氯生等污染物的基因毒性。
- 临床研究：潜在应用于癌症或衰老相关疾病的生物标志物筛查。
六、研究亮点
- 方法创新：GCES无需DNA变性或荧光标记，成本低且操作简便。
- 酶学特性：Pab-AGOG对8OG的切割特异性优于传统OGG1酶。
- 多场景适用性：兼容合成DNA和复杂基因组样本，覆盖氧化应激与化学毒理模型。
七、其他有价值内容
- 支持数据：论文补充材料包含详细的寡核苷酸序列（表S1-S4）、蛋白序列（表S5-S6）和优化参数（图S1-S7）。
- 技术对比：GCES相较CRISPR-Cas或滚环扩增（RCA）方法，避免了复杂探针设计（第1.3节）。
（注：文中所有专业术语首次出现时均标注英文原文，如“无碱基位点（AP site）”）