本研究由巴西米纳斯吉拉斯联邦大学（Universidade Federal de Minas Gerais）形态学系的Vinícius Amorim Beltrami和Vanessa Pinho等学者共同完成。研究团队来自该校生物科学研究所的多个部门，包括形态学系、普通生物学系、生物化学与免疫学系、微生物学系以及生理学与生物物理学系。该研究成果以原创研究论文（original research paper）的形式，于2025年1月25日在线发表于《Inflammation Research》期刊（2025年第74卷，文章编号24），数字对象标识符（DOI）为10.1007/s00011-024-01985-3。
2019年底，由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引发的新型冠状病毒感染（COVID-19）在全球范围内爆发。COVID-19患者的临床表现谱系极为广泛，从无症状感染到致命性重症均有发生。在重症病例中，免疫系统失调被认为是关键致病因素，其特征表现为过度的炎症反应以及机体无法及时有效地建立抗病毒免疫应答。研究者在因COVID-19死亡的患者肺部组织中，发现了大量的中性粒细胞（neutrophils）、巨噬细胞（macrophages）以及中性粒细胞胞外陷阱（NETs），这些发现被视为COVID-19呼吸道症状严重程度和不良预后的标志物。
目前，针对COVID-19的获批治疗方案主要分为两类：一类是以瑞德西韦（remdesivir）和奈玛特韦/利托那韦（nirmatrelvir/ritonavir）为代表的抗病毒药物；另一类是以皮质类固醇（corticosteroids）、白细胞介素-6（IL-6）受体拮抗剂和巴瑞替尼（baricitinib）为代表的抗炎药物。然而，这些免疫疗法并非对所有患者有效，且可能引发不良事件，例如地塞米松（dexamethasone）治疗会增加机会性感染和高血糖的风险。此外，托珠单抗（tocilizumab）等抗体类疗法因成本高昂，在许多国家难以普及。因此，研发新型、经济的免疫疗法对于扩大COVID-19的治疗谱系、优化治疗方案及减少药物不良反应具有重要意义。
磷酸二酯酶-4（PDE4）抑制剂通过阻止环磷酸腺苷（cAMP）的降解来发挥强效的抗炎作用。cAMP信号通路在调节抗炎和免疫调控级联反应中扮演着核心角色，其下游效应包括抑制炎症介质分泌、遏制白细胞迁移与活化、诱导抗炎分子合成以及促进多形核白细胞凋亡。PDE4在白细胞中高度表达，使其选择性抑制剂成为减轻炎症性疾病的理想靶点。罗氟司特（roflumilast）、阿普司特（apremilast）和克立硼罗（crisaborole）是已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗慢性阻塞性肺疾病（COPD）、银屑病和特应性皮炎的选择性PDE4抑制剂。鉴于PDE4抑制剂明确的抗炎特性以及学界关于其可能成为COVID-19治疗药物的建议，本研究团队提出假设：罗氟司特治疗可能减轻β冠状病毒（betacoronavirus）肺部感染临床前模型中的肺损伤和炎症反应。
本研究采用两种不同的给药策略（治疗性策略和预防性策略）以及两种不同的小鼠β冠状病毒感染模型（MHV-3模型和SARS-CoV-2模型）来系统验证罗氟司特的疗效。整个研究流程可分为以下六个主要环节：
第一环节：实验动物与病毒株准备。研究选用6-8周龄的C57BL/6野生型（WT）雄性小鼠进行MHV-3感染实验，体重为23±2克。对于SARS-CoV-2感染实验，则选用6-8周龄、表达人血管紧张素转换酶2（hACE2）受体的转基因小鼠（K18-hACE2，C57BL/6背景），包含雌性和雄性个体，雌性体重19±2克，雄性体重23±2克。病毒方面，MHV-3（GenBank登记号MW620427.1）在L929细胞中扩增培养；SARS-CoV-2伽马变体（P.1谱系，编号EPI_ISL_1060902）则在Vero E6细胞上分离培养，由Ezequiel Dias基金会（FUNED-MG）的Sergio Caldas博士惠赠。
第二环节：病毒感染造模。在MHV-3感染实验中，C57BL/6 WT小鼠经腹腔注射麻醉后，接受滴鼻接种3×10³噬斑形成单位（PFU）的MHV-3病毒液（体积30微升生理盐水）。在SARS-CoV-2感染实验中，K18-hACE2小鼠同样经腹腔麻醉后，滴鼻接种2×10⁴ PFU的SARS-CoV-2伽马变体病毒液。未感染对照组动物仅接受等体积生理盐水滴鼻。
第三环节：罗氟司特药物干预方案。研究团队将市售的罗氟司特片剂（商品名：Daxas®，每片含500微克罗氟司特）溶解于0.5%羧甲基纤维素钠（CMC）溶液中制成灌胃混悬液。实验设计了三种不同的给药方案：（1）MHV-3治疗性低剂量方案：于感染后第2天单次给予罗氟司特1 mg/kg；（2）MHV-3治疗性高剂量方案：于感染后第2天单次给予罗氟司特10 mg/kg；（3）MHV-3预防性给药方案：于感染前1小时、感染后第1天和第2天分别给予罗氟司特10 mg/kg，共计三次；（4）SARS-CoV-2治疗性给药方案：于感染后第4天单次给予罗氟司特10 mg/kg。MHV-3感染小鼠于感染后第3天实施安乐死并采集血液与肺组织样本；SARS-CoV-2感染小鼠则于感染后第5天进行样本采集。
第四环节：组织病理学与免疫学检测。肺组织经3.7%甲醛溶液固定、石蜡包埋后，切成5微米厚切片进行苏木精-伊红（H&E）染色。由病理科医师以盲法方式进行肺组织炎症评分，评估参数包括气道炎症（0-4分）、血管炎症（0-4分）、实质炎症（0-5分）和中性粒细胞浸润（0-5分）。炎症严重程度分级为：无炎症（0-1分）、轻度（2-5分）、中度（6-9分）、重度（10-14分）和极重度（15-18分）。此外，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测肺组织匀浆中趋化因子CXCL1、CCL2和细胞因子IL-1β、IL-6、TNF、IFN-γ、IL-10及TGF-β的浓度。免疫组织化学染色（IHC）采用兔单克隆抗Ly6G抗体标记中性粒细胞，免疫荧光染色（IF）则采用F4/80 APC抗体标记巨噬细胞。图像分析使用ImageJ软件和Fiji软件完成，共聚焦显微镜采用Zeiss LSM 880 Meta倒置共聚焦显微镜，在UFMG图像采集与处理中心（CAPI-UFMG）完成拍摄。
第五环节：病毒载量检测。MHV-3的肺部病毒滴度通过噬斑试验（plaque assay）测定。将稀释后的肺组织匀浆接种于L929细胞单层，在含0.8% CMC的DMEM培养基中培养3天后，以4%甲醛溶液固定并用0.1%结晶紫染色，病毒滴度以log10 PFU每克组织表示。SARS-CoV-2的病毒载量则通过实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测，RNA提取使用QIAamp® Viral RNA Kit，逆转录采用iScript™ gDNA Clear cDNA Synthesis Kit，qPCR反应采用GoTaq® Probe qPCR系统在StepOne™实时荧光定量PCR系统上运行，引物、探针和循环条件均按照美国疾病控制与预防中心（CDC）推荐方案执行。
第六环节：血液学指标分析。在MHV-3感染实验中，采用Celltac MEK-6500K全自动血细胞分析仪检测全血中淋巴细胞和中性粒细胞数量。在SARS-CoV-2感染实验中，因生物安全三级实验室（BSL-3）条件限制，采用血球计数板在显微镜下进行人工计数。
MHV-3感染导致小鼠肺部出现显著炎症反应，表现为白细胞与内皮细胞相互作用、血管周围和细支气管周围炎症浸润、细胞坏死和出血等病理改变。以1 mg/kg治疗性给药对肺组织病理学改变无明显改善作用。然而，以10 mg/kg高剂量进行治疗后，MHV-3感染小鼠的肺部炎症评分显著降低，肺组织呈现接近健康状态的外观。这一结果确立了高剂量罗氟司特在MHV-3模型中的肺保护功效。
肺组织匀浆检测结果显示，MHV-3感染显著升高了趋化因子CXCL1和CCL2、促炎细胞因子IL-1β、IL-6和IFN-γ以及抗炎细胞因子IL-10的水平，但对TGF-β水平无影响。低剂量（1 mg/kg）罗氟司特对这些炎症介质的浓度无显著影响。而高剂量（10 mg/kg）罗氟司特治疗显著降低了肺组织中CXCL1和CCL2这两种关键趋化因子的浓度，其他促炎分子也呈现下降趋势。鉴于CXCL1是中性粒细胞募集的主要趋化因子，CCL2则负责单核/巨噬细胞的招募，研究者进一步检查了这两种白细胞在肺组织中的聚集情况。Ly6G免疫组化染色显示，MHV-3感染小鼠肺泡区域以及血管和细支气管周围区域的Ly6G阳性细胞数量增加，且在血管周围和细支气管周围区域形成了中性粒细胞聚集体（neutrophil aggregates）。低剂量罗氟司特未能改变这一现象，而高剂量罗氟司特治疗虽未显著减少Ly6G阳性细胞绝对数量，却有效地阻止了这些异常中性粒细胞聚集体的形成。同时，F4/80免疫荧光检测表明，MHV-3感染导致肺组织巨噬细胞显著积累。高剂量罗氟司特治疗则显著减少了巨噬细胞的积累。综合而言，这些数据揭示了高剂量罗氟司特通过抑制趋化因子分泌、降低巨噬细胞积累以及阻止中性粒细胞异常聚集来减轻MHV-3诱导的肺部炎症。
为评估罗氟司特的抗炎作用是否会损害宿主的抗病毒防御能力，研究者检测了肺组织中的病毒滴度。结果显示，无论是低剂量还是高剂量的治疗性罗氟司特给药，均未对MHV-3在肺组织中的清除产生影响，提示罗氟司特的抗炎保护效应并不以牺牲病毒清除为代价。
MHV-3感染引发了类似COVID-19的血液学改变，包括白细胞减少症（leukopenia）和淋巴细胞减少症（lymphopenia），而血液中性粒细胞计数无变化，从而导致中性粒细胞与淋巴细胞比值（NLR）升高。高剂量罗氟司特治疗显著阻止了白细胞减少和淋巴细胞减少的发生，同时导致循环中性粒细胞数量轻微增加，最终使得NLR比值降低。这表明罗氟司特能够有效改善MHV-3感染所致的全身性血液学异常。
为模拟已长期服用罗氟司特的患者在感染情况下的疾病进程，研究者设置了预防性给药方案（感染前1小时开始给药，持续至感染后第2天）。与治疗性给药的保护效果截然相反，预防性给予10 mg/kg罗氟司特显著加重了MHV-3感染小鼠的肺损伤程度，肺组织中出现了大面积的坏死细胞区域。这一发现提示在感染早期阶段使用该药可能存在风险，过早的免疫抑制可能为病毒复制提供有利环境，从而加剧组织损伤。
为在更为直接的COVID-19模型中验证上述发现，研究者利用K18-hACE2转基因小鼠感染SARS-CoV-2伽马变体，并在感染后第4天进行治疗性给药（罗氟司特10 mg/kg）。感染后第5天的肺组织病理学分析显示，SARS-CoV-2感染引起了中度的血管周围和细支气管周围炎性浸润。治疗性给予罗氟司特显著减轻了SARS-CoV-2感染小鼠的肺损伤程度。值得关注的是，在MHV-3模型中并未观察到罗氟司特影响病毒清除，而在SARS-CoV-2模型中，罗氟司特治疗显著降低了肺组织中SARS-CoV-2病毒RNA的水平，显示出特异性抗病毒效果。在细胞因子和趋化因子方面，由于在感染后第5天这一研究时间点，SARS-CoV-2感染本身并未引起肺组织炎症介质浓度的显著变化，因而未能评估罗氟司特对炎症介质水平的调节作用。这一局限性与该模型的动力学特征有关，即炎症介质变化在感染后第3天即可测得，而肺损伤高峰则出现于第5至第6天。此外，与MHV-3模型不同，罗氟司特治疗并未改善SARS-CoV-2感染引起的白细胞减少症。
本研究得出以下核心结论：选择性PDE4抑制剂罗氟司特在治疗性给药方案下，能够在不损害病毒清除能力的前提下，显著减轻MHV-3和SARS-CoV-2两种β冠状病毒感染小鼠的肺损伤。在MHV-3模型中，其保护机制与降低趋化因子CXCL1和CCL2水平、减少巨噬细胞肺内积累以及阻止中性粒细胞异常聚集密切相关。该研究的科学价值在于，通过两种互补的临床前模型，系统阐明了PDE4靶向治疗在冠状病毒性肺炎中的治疗潜力与用药时机的重要性。研究明确区分了治疗性用药与预防性用药的截然不同结局，为免疫调节药物在病毒感染中的应用提供了重要的安全警示。在应用价值层面，鉴于罗氟司列特是已获批上市的人用药物，其安全性和药代动力学特性已有充分数据支持，这意味着其向COVID-19临床应用的转化路径相对较短，且成本较新型生物制剂更为经济，有望在全球范围内提高重症COVID-19治疗的可及性。
本研究具有以下重要亮点：其一，首次在MHV-3小鼠模型中系统验证了罗氟司特的双重特性，即治疗性给药的肺保护和预防性给药的病情加重效应，揭示了用药时机在病毒感染抗炎治疗中的决定性作用。其二，在SARS-CoV-2直接感染模型中证实罗氟司特不仅具有抗炎效果，还展现出降低病毒RNA载量的作用，这一发现与另一PDE4抑制剂CC-11,050在仓鼠模型中的研究结果相呼应，提示PDE4抑制可能通过增强宿主免疫调节功能来间接促进病毒清除。其三，本研究通过免疫组织化学和免疫荧光技术，从细胞层面精细描绘了罗氟司特对中性粒细胞空间分布行为（阻止异常聚集体形成）的独特调控作用，而不仅仅是简单地减少细胞数量。其四，研究方法的有机结合值得借鉴，先利用生物安全二级（BSL-2）条件下的MHV-3模型进行机制探索和剂量筛选，再于BSL-3条件下的SARS-CoV-2模型中进行关键结论的验证，这种研究策略兼顾了实验可行性与临床相关性。