本文是由Satoshi Watanabe、Kazuyuki Hashimoto以及Noriko S. Ishioka三位研究人员共同完成的一项原始研究，并于2015年发表在《Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry》期刊上（于线上发布于2014年9月19日）。作者单位均为日本原子能机构的量子束科学中心（Quantum Beam Science Center, Japan Atomic Energy Agency）。
本研究是在核医学领域，特别是放射性同位素治疗（Radioimmunotherapy, RIT）中放射性标记技术范畴内的一项基础性工作。在过去的数年中，放射性核素镥-177（¹⁷⁷Lu）因其优良的核性质——发射适合穿透微小肿瘤的β粒子（最大能量498 keV，在软组织中的最大射程约2毫米），以及相对较长的物理半衰期（6.734天，足以使标记抗体在肿瘤部位富集）——已成为一种极具前景的用于放射性核素治疗的核素。此外，¹⁷⁷Lu还发射适合于单光子发射计算机断层扫描（Single Photon Emission Computed Tomography, SPECT）成像的γ射线（能量113和208 keV），使得在治疗过程中可视化和监控药物体内分布成为可能。因此，开发高效的¹⁷⁷Lu标记方法至关重要，而双功能螯合剂（Bifunctional Chelating Agents）是实现将¹⁷⁷Lu稳定络合到抗体等生物活性分子上的关键化学桥梁。
在此背景下，DOTA（1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸）和DTPA（二乙烯三胺五乙酸）是两种常用的双功能螯合剂。然而，研究人员在实际标记过程中遇到了挑战。他们利用自己早期开发的反相离子对液相色谱法生产的高纯度无载体添加（no-carrier-added）¹⁷⁷Lu标记DOTA-抗体时，发现来自化学试剂的金属杂质，特别是钙（Ca）、铁（Fe）和锌（Zn），会严重抑制¹⁷⁷Lu与DOTA之间的络合反应。这种抑制被认为与这些竞争性金属离子自身与螯合剂形成高稳定常数络合物的能力有关。尽管有这些金属与螯合剂络合稳定常数的数据，但在¹⁷⁷Lu标记过程中，当多种金属离子共存时，这些数据如何预测和解释¹⁷⁷Lu络合效率的下降，特别是不同金属离子抑制效应的差异，尚不明确。因此，本研究旨在系统地探究在竞争性金属离子（Ca(II)、Fe(II)、Zn(II)）存在下，DOTA和DTPA与¹⁷⁷Lu的络合行为差异，从而为选择更适合用于¹⁷⁷Lu标记抗体、尤其是在存在杂质金属离子的实际生产环境下的螯合剂提供实验依据。研究的主要目标是比较DOTA和DTPA在含竞争性金属环境中的¹⁷⁷Lu络合效率，并确定何种螯合剂更优，以及哪种竞争性金属的抑制效应最强。
研究的工作流程可以分为几个关键步骤。首先，研究者们准备了实验所需的所有高纯度试剂，包括购自Sigma公司的DOTA、购自Parish Chemical公司的DTPA，以及各种金属盐（Ca(II) acetate monohydrate, Fe(II) acetate, Zn(II) acetate dehydrate）和用于配制缓冲液的超纯级别酸、碱和水。使用这些高纯度试剂的目的是确保实验中所添加的竞争性金属离子浓度远高于试剂本底杂质水平，从而可以将本底金属杂质的影响忽略不计。实验使用了含载体的¹⁷⁷Lu，通过核反应¹⁷⁶Lu(n, γ)¹⁷⁷Lu制备，以便在化学计量学层面精确控制Lu(III)的总浓度，研究其与竞争金属的相互作用。制备过程具体如下：将含有0.1毫升（1,000 ppm浓度）Lu标准溶液的密闭石英安瓿置于日本原子能机构的研究反应堆JRR-3中进行热中子辐照（通量为1×10¹⁴ n cm⁻² s⁻¹，时长7小时）。辐照结束后，将安瓿中的残留物溶解于0.1 M的盐酸中，最终获得的¹⁷⁷Lu溶液在辐照结束时的活度为77 MBq。
接下来是络合实验的核心步骤。络合反应在特定条件下进行。首先，在一个反应体系中混合以下组分：5微升的¹⁷⁷Lu溶液（其总Lu浓度，包括稳定Lu和¹⁷⁷Lu，为5.0 × 10⁻⁵ M）、5微升的竞争性金属离子溶液（Ca(II)、Fe(II)或Zn(II)），其浓度变化范围从2.5 × 10⁻⁵ M到2.5 × 10⁻³ M，以此来实现[金属(II)]/[Lu(III)]的摩尔比从0.5变化到50。然后，向此混合物中加入1微升的3 M、pH = 6.0的醋酸盐缓冲液，以维持反应体系的酸碱度。最后，加入10微升浓度为5.0 × 10⁻⁵ M的DOTA或DTPA溶液。需要注意的是，在反应溶液中，DOTA或DTPA的最终浓度是Lu(III)总浓度的两倍，这就意味着当竞争金属离子与Lu(III)的摩尔比大于1时，金属离子和Lu(III)之间会竞争性地与有限量的螯合剂配体结合。将上述混合溶液在40°C下孵育1.5小时后，使用薄层色谱法（Thin Layer Chromatography, TLC）分析络合产率。具体方法是：使用硅胶薄层板（ITLC silica gel），以氨水：甲醇：水（体积比0.2:2:4）作为展开剂。在此色谱体系中，未反应的游离¹⁷⁷Lu会停留在硅胶条的起始点（原点），而成功形成的¹⁷⁷Lu-DOTA或¹⁷⁷Lu-DTPA络合物则会随溶剂前沿移动。通过测定原点和前沿区域的放射性活度，可以计算出络合产率，其定义为形成¹⁷⁷Lu-螯合剂络合物的放射性占初始用于络合反应的¹⁷⁷Lu总放射性的百分比。实验中没有使用新颖或自创的实验方法，所有步骤均基于成熟的放射性化学与色谱分析技术，但整个实验设计针对性地、系统地考察了不同竞争金属在不同浓度比例下对两种常见螯合剂性能的影响，这本身构成了研究方法的特色。数据分析的核心是将测得的络合产率与[金属(II)]/[Lu(III)]的比值作图，直观比较不同金属、不同螯合剂下的抑制曲线。
研究获得了详细且清晰的结果。图1（a-c）分别展示了在Ca(II)、Fe(II)和Zn(II)存在下，¹⁷⁷Lu与DOTA及DTPA络合产率的变化。对于Ca(II)，DOTA的¹⁷⁷Lu络合产率在[Ca(II)]/[Lu(III)]比值达到5之前均保持较高水平，之后随着该比值的增加而逐渐下降。与之形成鲜明对比的是，DTPA的络合产率在[Ca(II)]/[Lu(III)]比值高达50时依然能维持在较高水平，显示出DTPA对Ca(II)竞争极强的抵抗能力。对于Fe(II)，DOTA和DTPA两者的络合产率都随着[Fe(II)]/[Lu(III)]比值的增加而下降，但DOTA的下降曲线（抑制效应）比DTPA更为陡峭，说明Fe(II)对DOTA络合Lu的抑制作用更强。对于Zn(II)，情况与Fe(II)类似，两种螯合剂的络合产率均随[Zn(II)]/[Lu(III)]比值增加而下降，且DOTA的下降同样比DTPA更加急剧。这些曲线图直接提供了实验结果。
为了量化比较不同竞争金属的抑制强度，研究者从实验结果中总结出以下顺序：就DOTA而言，其对¹⁷⁷Lu的络合能力受抑制的强弱顺序为Zn(II) < Fe(II) < Ca(II)（注：此处“<”表示抑制作用更强，根据原文“zn(ii) < fe(ii) < ca(ii)”及图1解读，在相同[金属]/[Lu]比值下，Zn存在时DOTA-Lu产率最低，即Zn抑制最强，Ca抑制最弱）。而就DTPA而言，抑制强弱顺序为Fe(II) < Zn(II) < Ca(II)（即Fe抑制最强，Ca抑制最弱）。更重要的是，从螯合剂之间横向比较，在所有三种竞争金属存在的情况下，DTPA的¹⁷⁷Lu络合产率均高于DOTA，即DOTA < DTPA，这表明在存在这些杂质金属的环境中，DTPA是更优越的¹⁷⁷Lu络合剂。
研究者随后尝试利用文献中查得的络合物稳定常数（logKML）来解释这些实验现象。他们计算了竞争金属离子（M’）与Lu(III)的稳定常数比值对数 log(KML(M’)/KML(Lu))。理论上，该比值越小，意味着Lu(III)相对于竞争金属离子与螯合剂络合的优势越大，预期¹⁷⁷Lu络合产率应越高。根据NIST标准参考数据库46的数据计算，对于DOTA，该比值的顺序是Ca(II) < Zn(II) < Fe(II)；对于DTPA，顺序是Ca(II) < Fe(II) < Zn(II)。如果仅凭稳定常数理论预测，那么DOTA对¹⁷⁷Lu的络合能力（受抑制程度）顺序应为Fe(II) < Zn(II) < Ca(II)，而DTPA的顺序应为Zn(II) < Fe(II) < Ca(II)。然而，这一预测顺序与上述实验观察到的顺序并不完全一致，特别是对于DOTA的情况。这表明，仅用热力学稳定常数不足以完全解释实验数据。论文引用前人研究（Lie等人和De León-Rodríguez等人）指出，金属离子与螯合剂的络合不仅与热力学稳定性有关，还与动力学稳定性（络合/解离速率）有关。因此，需要结合动力学因素才能完整理解观察到的竞争抑制现象。尽管如此，稳定常数比较仍然提供了一个有价值的视角：对比DOTA和DTPA，对于所有三种竞争金属，DTPA的 log(KML(M’)/KML(Lu)) 比值均小于DOTA，这从理论上支持了DTPA在存在竞争金属时络合Lu的可能性更高（即DOTA < DTPA）的实验结论，这部分预测与实验结果相符。
基于以上结果，研究得出了明确的结论。首先，在存在竞争性金属离子Ca(II)、Fe(II)和Zn(II)的情况下，DTPA是比DOTA更优越的¹⁷⁷Lu络合剂。其次，特别重要的是，由于Fe(II)对DTPA络合¹⁷⁷Lu的抑制作用在三种金属中是最强的（就DTPA而言），因此，当使用DTPA作为¹⁷⁷Lu标记抗体的双功能螯合剂时，从无载体添加的¹⁷⁷Lu生产溶液中去除铁杂质将显得尤为关键和有效。这项研究为放射性核素治疗，特别是基于无载体添加¹⁷⁷Lu的放射免疫治疗中，双功能螯合剂的选择提供了重要的实验依据。其科学价值在于首次系统地实验评估并比较了在生理相关金属杂质（Ca、Fe、Zn）存在下，DOTA和DTPA对¹⁷⁷Lu的络合性能，揭示了稳定常数理论预测与实验观察之间的差异，提示在复杂体系中需同时考虑热力学和动力学因素。其应用价值在于直接指导生产实践：为了获得高产率、高比活度的¹⁷⁷Lu标记抗体药物，尤其是在使用可能含有金属杂质的¹⁷⁷Lu原料时，应优先考虑DTPA或其衍生物作为螯合剂，并应严格控制、特别是去除溶液中的铁离子污染，以最大化标记效率。
本研究的亮点突出。第一，重要的研究发现：明确得出DTPA在竞争金属环境中优于DOTA的结论，并特别指出铁离子对DTPA络合Lu的抑制作用最强，这一发现对实际工艺优化有直接指导意义。第二，研究目标具有明确的针对性和实用性：聚焦于放射免疫治疗药物制备过程中遇到的具体实际问题——金属杂质抑制标记效率，而非单纯的理论络合化学研究。第三，系统性的实验设计：通过严格控制金属离子与Lu的摩尔比，系统性地绘制了抑制曲线，使得比较更加直观和量化。第四，理论与实践的结合与探讨：不仅呈现了实验数据，还尝试用热力学稳定常数进行解释，并指出了其局限性，引出了动力学因素的重要性，为后续更深入的研究提供了方向。最后，该研究基于研究者团队自身在¹⁷⁷Lu生产方面的前期工作，形成了从同位素生产到标记化学应用研究的连贯性探索，体现了从基础到应用的研究思路。