本研究由捷克共和国布尔诺兽医研究所新发病毒性疾病实验室的Michal Štefánik、Andrew D. Miller和Luděk Eyer等人完成，合作单位包括布尔诺孟德尔大学、帕尔杜比采大学以及捷克科学院寄生虫学研究所。论文发表于MDPI旗下的开放获取期刊《Viruses》（Viruses 2022, 14, 354），于2022年2月9日正式刊出。
本研究的核心科学问题是探索天然木脂素化合物diphyllin（二叶草素）对多种医学重要包膜RNA病毒和DNA病毒的广谱抗病毒活性及其作用机制。Diphyllin是从热带植物中提取的芳基萘内酯类木脂素，常见于传统中药使用的植物如Cleistanthus collinus和Justicia gendarussa中。此前研究已证实diphyllin是液泡型ATP酶（vacuolar (H+)ATPase，V-ATPase）的强效抑制剂，能够阻断内体的酸化过程。由于许多包膜病毒在通过受体介导的内吞作用进入宿主细胞后，依赖内体酸化来触发病毒包膜与内体膜的融合，因此V-ATPase抑制剂被认为可能成为广谱抗病毒药物。本研究旨在验证diphyllin对黄病毒科（Flaviviridae）、白纤病毒科（Phenuiviridae）、弹状病毒科（Rhabdoviridae）和疱疹病毒科（Herpesviridae）多种代表性病毒的抑制作用，并进一步探索其是否仅通过抑制内体酸化发挥作用。
在实验流程方面，本研究首先对diphyllin的合成路线进行了改进和优化。作者参考已有文献，从3,4-二羟基苯甲醛出发制备苯并[1,3]二氧戊环-5-甲醛中间体2，同时将2-溴-4,5-二甲氧基苯甲醛与1,3-丙二硫醇缩合得到二噻烷中间体3。两种中间体通过正丁基锂介导的转金属化反应偶联生成醇类中间体4，随后经二氧化锰氧化为二苯甲酮中间体5。关键步骤是利用双（三甲基硅基）氨基锂（LiHMDS）在-65°C低温条件下使2(5H)-呋喃酮发生分子间Michael加成并关环，生成四氢萘并呋喃酮中间体6。此前文献中使用的二异丙基氨基锂（LDA）在本实验室条件下产生多种副产物，而LiHMDS的使用显著提高了反应选择性，并可回收未反应的原料。中间体6经氧化汞/氯化汞脱除二噻烷保护得到二酮中间体7，最后在对甲苯磺酸催化下芳构化得到目标化合物diphyllin 1。该合成路线总产率约15%，所有中间体均通过核磁共振、红外光谱、高分辨质谱和元素分析进行了完整表征。作者还发现diphyllin对光敏感，需避光冷藏保存以维持抗病毒活性。自制diphyllin与商业样品在抗蜱传脑炎病毒（TBEV）活性上无显著差异，EC50值分别为1.04 μM和1.24 μM。
在抗病毒实验设计中，作者采用了三种不同的给药时序：感染前2小时预处理、感染同时给药以及感染后2小时给药。对于TBEV、西尼罗病毒（WNV）、寨卡病毒（ZIKV）、裂谷热病毒（RVFV）和单纯疱疹病毒1型（HSV-1），均使用Vero细胞进行病毒滴度降低实验，病毒感染复数（MOI）为0.1，药物浓度范围为0–25 μM，孵育48小时后通过空斑实验测定病毒滴度。对于狂犬病毒（RABV），由于其在48小时内难以产生足够高的滴度，作者将孵育时间延长至72小时，并采用BHK-21细胞进行实验。病毒RNA通过定量逆转录PCR（RT-qPCR）进行定量。细胞毒性实验则涵盖了Vero、PS、UKF-NB-4、Huh-7、原代人脑皮质星形胶质细胞（HBCA）和BHK-21等多种细胞系，药物浓度最高达100 μM，孵育时间根据细胞类型分别为48、72或144小时。免疫荧光染色用于检测病毒表面抗原的表达水平，使用针对黄病毒E蛋白的单克隆抗体D1-4G2-4-15、单纯疱疹病毒抗体和RVFV核蛋白抗体，以异硫氰酸荧光素（FITC）标记的二抗进行显色。在内体酸化分析中，作者使用吖啶橙染料染色Vero细胞，以巴佛洛霉素A1（bafilomycin A1）作为阳性对照，通过红色与绿色荧光信号的相对强度判断内体酸化程度。
细胞毒性结果显示，diphyllin和其糖苷类似物cleistanthin B对Vero和BHK-21细胞在100 μM浓度下基本无毒性，但对UKF-NB-4、Huh-7和HBCA细胞具有剂量依赖性毒性，48小时半数细胞毒性浓度（CC50）分别为11.13、1.89和3.39 μM。Vero细胞在144小时长时间暴露下CC50为18.19 μM。基于这些结果，作者选择Vero细胞进行TBEV、WNV、ZIKV、RVFV和HSV-1的抗病毒实验，BHK-21细胞用于RABV实验。
抗病毒活性结果显示，diphyllin对TBEV、WNV、ZIKV、RVFV和HSV-1均表现出亚微摩尔或低微摩尔水平的半数有效浓度（EC50），分别为0.85、0.78、0.54、0.46和0.59 μM（均为感染前2小时给药条件下测得）。其中对RABV的EC50为6.33 μM。在12.5–25 μM浓度下，diphyllin能够几乎完全抑制TBEV、WNV、ZIKV和RVFV的复制，对HSV-1的完全抑制浓度更低至2.5 μM。三种给药时序中，感染前2小时给药始终表现出最强的抗病毒效果，提示diphyllin可能在病毒进入细胞之前就已改变宿主细胞的内体环境。相比之下，cleistanthin B对TBEV的EC50为5.53 μM，活性显著低于diphyllin，因此后续研究中未继续使用该化合物。免疫荧光染色结果与病毒滴度数据一致，显示diphyllin以剂量依赖性方式减少病毒表面抗原表达，在12.5–25 μM浓度下几乎完全消除抗原信号。
在作用机制研究中，作者首先通过吖啶橙染色证实diphyllin（100 μM）能够抑制Vero细胞内体酸化，使红色荧光显著减少，但其效力低于巴佛洛霉素A1（100 nM）。巴佛洛霉素A1对ZIKV的EC50为2.44 nM，比对diphyllin的EC50低约1000倍，表明巴佛洛霉素A1对ZIKV的抑制效力远高于diphyllin。然而，巴佛洛霉素A1在高达100 nM浓度下对HSV-1无抑制作用。进一步的时程实验表明，在感染后仅3小时的短期给药条件下，diphyllin和巴佛洛霉素A1均能抑制ZIKV的感染性；但HSV-1在3小时给药时对两种药物均不敏感，而在72小时持续性给药时对diphyllin高度敏感，对巴佛洛霉素A1仍不敏感。这一结果表明，diphyllin对HSV-1的主要作用靶点不在病毒进入宿主细胞的早期阶段（即内吞和膜融合阶段），而可能作用于病毒复制周期的后期阶段，如病毒复制、组装或释放等环节。
综合以上结果，研究得出结论：diphyllin是一种广谱的宿主细胞靶向抗病毒药物，能够有效抑制多种系统发育上互不相关的包膜RNA和DNA病毒。其抗病毒机制不仅限于已知的V-ATPase抑制作用，还可能涉及其他尚未阐明的机制，特别是在针对HSV-1这类不依赖内体酸化进入细胞的病毒时尤为明显。该研究为diphyllin作为未来广谱抗病毒药物候选物提供了系统的体外实验依据，同时也为后续开发结构优化的diphyllin衍生物奠定了合成方法学基础。
本研究的亮点包括：第一，建立了改进的diphyllin全合成路线，解决了文献方法重现性差和关键中间体表征不全的问题，为低成本、大规模获取diphyllin用于后续药理研究提供了可靠途径；第二，首次系统评价了diphyllin对TBEV、WNV、RVFV和RABV等病毒的抑制作用，拓宽了其已知的抗病毒谱；第三，通过对比diphyllin和巴佛洛霉素A1在ZIKV和HSV-1感染模型中不同给药时间点的作用差异，揭示了diphyllin可能具有独立于V-ATPase抑制的额外抗病毒机制，这一发现挑战了以往将其简单归类为内体酸化抑制剂的认识。此外，研究还对diphyllin和cleistanthin B的细胞毒性进行了多细胞系和时间依赖性的系统评估，为后续体内实验的安全性评价提供了参考数据。