这是一项关于急性缺血性卒中静脉溶栓后早期神经功能恶化的原创性研究。该研究由首都医科大学宣武医院神经内科的李佳敏、王梓欣、赵海萍及马青峰等学者合作完成，发表于 Translational Stroke Research 期刊2026年第17卷，论文编号52。本文报道了通过血浆外泌体蛋白质组学分析，揭示免疫血栓形成相关蛋白特征并鉴定预测缺血性早期神经功能恶化（ischemic early neurological deterioration，ENDI）的生物标志物。

研究背景

卒中是全球第三大致死原因，其中缺血性卒中最为常见。静脉溶栓是急性缺血性卒中（acute ischemic stroke，AIS）的主要再灌注治疗手段，但仍有6.7%至31.0%的患者在溶栓后发生早期神经功能恶化（early neurological deterioration，END），显著增加不良功能结局和死亡风险。END的主要原因是缺血性进展，占全部END病例的三分之二以上，其病理机制远不如出血转化明确。因此，寻找能够预测缺血性早期神经功能恶化（ENDI）的生物标志物具有重要的临床意义。传统的血液标志物如超敏C反应蛋白、白介素-6、C型凝集素样受体2及神经元特异性烯醇化酶等，虽然与END有一定关联，但特异性低、易受全身状态干扰且稳定性不足。外泌体作为细胞外囊泡的重要亚型，能够穿越血脑屏障，其携带的蛋白质、脂质、DNA及miRNA等分子可反映亲代细胞状态，且在外周体液中高度稳定，适合动态监测。然而，既往关于外泌体的研究多集中于miRNA和circRNA，基于外泌体蛋白质组学预测溶栓后ENDI的研究仍属空白。

研究流程

该研究分为探索阶段和验证阶段。

在探索阶段，研究团队于2023年10月至2024年7月在首都医科大学宣武医院前瞻性招募了110例接受静脉溶栓的AIS患者，排除接受机械取栓、溶栓后颅内出血、恶性脑水肿、严重合并症、临床资料不全及无血标本的患者后，最终纳入3例ENDI患者和5例早期神经功能改善（early neurological improvement，ENI）患者，并按年龄和性别进行频数匹配。ENDI定义为24小时NIHSS评分较基线恶化≥2分且无影像学明显出血证据；ENI定义为24小时NIHSS评分改善≥4分或降至0分。在入院时和溶栓后24小时两个时间点采集静脉血，分离血浆后通过超速离心法提取外泌体，并通过透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）、纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）和蛋白质印迹（western blot，WB）验证外泌体形态、粒径及标志蛋白CD9和CD81。随后，对16份血浆外泌体样本进行4D数据非依赖采集（data-independent acquisition，DIA）质谱蛋白质组学检测，共鉴定到1238种外泌体蛋白。蛋白鉴定和定量使用DIA-NN软件（版本1.8）完成，假发现率控制在1%。数据分析主要使用R语言（版本4.0）完成，包括基因本体（gene ontology，GO）、KEGG通路、Reactome通路及InterPro结构域富集分析；免疫细胞和脑细胞来源分析分别采用CIBERSORT和BRETIGEA R包；基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）使用GSEA软件（v4.1.0）和MSigDB数据库；差异表达蛋白（differentially expressed proteins，DEPs）采用MetaX包筛选，标准为倍数变化>1.2且t检验p值<0.05；蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络基于STRING数据库构建，置信度≥0.4，并通过CytoHubba插件（Degree算法）鉴定核心蛋白。

在验证阶段，研究团队于2024年7月至2025年2月采用相同标准独立纳入30例患者（5例ENDI和25例非ENDI）。使用Hieff® Quick外泌体提取试剂盒分离外泌体，通过酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）分别检测外泌体裂解液和原始血浆中候选蛋白TIMP1、PRKACA和CCL5的浓度。此外，为评估外泌体对缺血神经元的直接作用，从2025年10月至12月招募的3例ENDI和3例ENI患者中分离血浆外泌体，以1×10¹¹颗粒/ml的浓度处理氧糖剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）模型的人SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞，通过CCK-8实验检测细胞活力。

主要结果

外泌体特征鉴定显示，分离的外泌体呈杯状形态，ENDI组和ENI组外泌体平均粒径分别为130.7 nm和139.7 nm，基线外泌体浓度无显著差异，且均表达CD9和CD81。

细胞来源分析表明，基线时两组间免疫细胞和脑细胞来源的外泌体蛋白水平无显著差异。溶栓后，ENDI组单核细胞来源的外泌体蛋白显著下调，而ENI组初始B细胞（naive B cell）来源的外泌体蛋白显著上调，同时神经元来源蛋白显著减少。

GSEA分析揭示，ENDI组血小板聚集（GO）、趋化因子信号通路（KEGG）显著富集，而体液免疫（GO）和补体介导的免疫（Reactome）通路被显著抑制。此外，糖酵解和HSP90伴侣循环（针对类固醇激素受体）在ENDI组上调。

在基线DEPs分析中，共鉴定到69个差异蛋白，其中52个上调、17个下调。上调蛋白的GO、KEGG和Reactome富集分析显示，血小板聚集、凝血级联、趋化因子信号、白细胞跨内皮迁移、中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular trap，NET）形成及血小板活化等通路显著激活。下调蛋白的GO分析显示，内皮细胞迁移、神经递质受体转运、补体C1复合物等过程受到抑制。PPI网络分析鉴定出前10位核心蛋白：ANXA5、HSPA8、CALR、PGK1、YWHAZ、VCL、PPIA、ARRB1、RAP1B和FGB。

通过综合筛选策略（差异倍数前10、血栓炎症相关通路交叉、PPI网络Degree≥5），最终确定TIMP1、PRKACA和CCL5为候选分子。验证队列ELISA结果显示，ENDI组外泌体TIMP1水平显著高于ENI组（p=0.017），血浆CCL5在ENDI组显著升高（p=0.009）。在ENDI与非ENDI比较中，CCL5是唯一在血浆（p=0.003）和外泌体（p=0.048）中均显著升高的候选分子。纵向分析显示，外泌体CCL5和TIMP1在溶栓前后变化显著，而血浆中对应蛋白的变化无统计学意义。体外实验中，各组外泌体对OGD/R处理的SH-SY5Y细胞活力均无显著影响。

研究结论及价值

该研究首次构建了AIS患者溶栓前后血浆外泌体蛋白的动态图谱，揭示了ENDI的免疫血栓形成机制：凝血级联、血小板活化、趋化因子信号和NET形成通路的协同激活，同时伴随补体和体液免疫通路的抑制。研究提出“单核细胞—B细胞—免疫球蛋白—补体系统”免疫抑制链在ENDI发病中的潜在作用，并推测HSP90-糖皮质激素受体轴的激活及糖酵解代谢重编程可能是上游驱动因素。外泌体CCL5被确立为预测溶栓后ENDI的可靠生物标志物，且外泌体形式的CCL5比血浆总CCL5更能反映溶栓后的动态生物学过程。

研究亮点

该研究的创新性体现在三个方面：其一，首次将4D-DIA蛋白质组学技术应用于溶栓后ENDI的外泌体研究，填补了该领域空白；其二，基于外泌体蛋白的细胞来源和通路富集分析，提出了体液免疫抑制参与ENDI的新机制；其三，通过独立队列验证了外泌体CCL5的预测价值，为临床早期预警和精准干预提供了潜在靶点。此外，研究还关注了既往被忽视的糖酵解和HSP90-类固醇受体通路在卒中进展中的作用，为未来靶向代谢和应激通路的神经保护治疗提供了新思路。