本文为单一原始研究论文，以下为学术报告。

该研究由浙江工业大学生物技术与生物工程学院、浙江省生物有机合成重点实验室的Linye Jiang、Qingxia Wen、Yuxi Wang、Zhuoming Tan、Qiuyue Wang、Fangfang Zhang及通讯作者Jingyan Ge等人完成，发表于*Journal of Materials Chemistry B*，2025年5月20日上线，卷号为13，页码7807–7818。

一、研究背景与目的

化疗是抑制肿瘤生长的重要手段，但因对正常细胞和肿瘤细胞的无差别攻击而常伴随严重全身毒副作用。为克服这一局限，研究者长期致力于开发能响应肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）的前药系统。肿瘤微环境具有乏氧、高活性氧（reactive oxygen species，ROS）和弱酸性等特征，其中过氧化氢（H₂O₂）在肿瘤组织中的浓度高于正常细胞，因而成为前药激活的重要触发因素。基于芳基硼酸或芳基硼酸酯的H₂O₂响应性前药可在生理条件下特异性释放活性药物。氮芥（chlormethine）作为一种应用超过70年的抗肿瘤药，虽经硼酸修饰可在一定程度上提高选择性，但细胞内H₂O₂的有限供应和快速消耗常导致前药激活效率不足。为突破这一瓶颈，可利用葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOx）在肿瘤部位催化葡萄糖生成葡萄糖酸和H₂O₂，通过“可逆点击”化学将GOx与苯硼酸修饰的氮芥前药偶联，实现H₂O₂的原位持续供给。然而，酶–前药系统的递送效率、酶活性保持及肿瘤部位时空控制仍面临巨大挑战。金属有机框架（metal–organic frameworks，MOFs）因其高孔隙率、大比表面积、可调功能化和良好生物相容性，为酶和前药的胞内递送提供了理想平台。其中，以Fe³⁺为金属中心的铁基MOF不仅能包载GOx和前药，还能利用GOx产生的H₂O₂参与芬顿反应（Fenton reaction），将铁死亡（ferroptosis）与化疗整合为协同抗肿瘤策略。铁死亡是一种非经典的程序性细胞死亡形式，其核心是细胞内铁与H₂O₂反应生成高细胞毒性的羟基自由基（•OH），引起脂质过氧化物（lipid peroxides，LPO）积累和氧化还原失衡。然而，肿瘤微环境中铁或H₂O₂不足常限制铁死亡疗效。基于上述背景，本研究提出构建一种透明质酸（hyaluronic acid，HA）功能化的铁基MOF级联纳米平台，将GOx与苯硼酸修饰氮芥前药形成的复合物（G–P）包载于谷胱甘肽（glutathione，GSH）响应性铁基MOF中，表面通过静电吸附修饰HA，以实现对CD44过表达肿瘤细胞的靶向递送和协同铁死亡–化疗。

二、研究流程与实验方法

研究首先以六水合氯化铁（FeCl₃·6H₂O）和二硫代二甘醇酸（dithiodiglycolic acid）为原料，自组装制备铁基MOF，并在合成过程中包载GOx，得到GOx@MOF。随后在GOx@MOF表面通过静电吸附修饰HA，得到GOx@MOF@HA。利用动态光散射（dynamic light scattering，DLS）和透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）表征纳米粒的粒径、zeta电位和形貌；通过X射线衍射（X-ray diffraction，XRD）确证MOF的非晶态结构；以异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作为模型蛋白，测定蛋白包封率（encapsulation efficiency，EE%）和负载量（loading capacity，LC%）。为评估GSH响应性，将GOX@MOF@HA与10 mM GSH孵育不同时间，通过TEM观察形貌变化，并利用BCA蛋白定量法测定GOx释放效率。用邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）检测GSH消耗，用邻菲罗啉（phenanthroline）检测Fe²⁺生成，用亚甲蓝（methylene blue，MB）降解法检测•OH生成，用商品化H₂O₂检测试剂盒测定GOx催化葡萄糖产生H₂O₂的能力。为验证前药在ROS激活下形成DNA链间交联的能力，以HT1080细胞中聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）获得的短双链DNA为底物，设置DNA、DNA+H₂O₂、DNA+前药、DNA+葡萄糖+GOx及DNA+药物等对照，通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA损伤。细胞实验采用HeLa和HT1080作为CD44高表达细胞模型，LO-2作为CD44低表达对照。以FITC标记BSA@MOF@HA进行激光共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscopy，CLSM）成像和流式细胞术（flow cytometry）分析细胞摄取选择性。细胞毒性采用CCK-8法检测，并设置铁死亡促进剂谷氨酸（glutamic acid，glu）和铁死亡抑制剂维生素C（vitamin C，VC）、谷胱甘肽（GSH）、去铁胺（deferoxamine，DFO）及ferrostatin-1（Fer-1）共处理实验。细胞内ROS和LPO分别用DCFH-DA和C11-BODIPY⁵⁸¹/⁵⁹¹探针检测；GPX4表达通过蛋白质印迹（western blot）检测。体内实验采用HeLa皮下荷瘤BALB/c裸鼠模型，分为PBS、MOF、GOX@MOF、GOX@MOF@HA和G–P@MOF@HA五组，每2天静脉注射一次，共6次，监测肿瘤体积和体重。治疗结束后取肿瘤及主要器官进行苏木精–伊红染色（hematoxylin and eosin，H&E）和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）分析，并通过western blot检测肿瘤组织GPX4表达。血液半衰期实验使用Cy5标记BSA，血液相容性通过溶血实验评估，生物安全性通过血液学和肝肾功能指标检测。

三、主要结果

GOX@MOF@HA的平均水合粒径约为124.5 nm，多分散指数（polydispersity index，PDI）为0.154，zeta电位由GOX@MOF的负值进一步降低至−15.8 mV，TEM显示所有纳米粒均保持均匀球形，HA或GOx的引入未改变MOF的非晶态特征。GOX@MOF@HA在PBS和10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）中7天内粒径稳定。以FITC-BSA为模型测得蛋白包封率接近100%，负载量为6.0 wt%。在10 mM GSH条件下，GOX@MOF@HA于4小时即出现明显结构破坏，12小时GOx释放效率接近100%；无GSH时几乎不释放。GOX@MOF@HA可显著消耗GSH，且随GSH浓度升高，Fe²⁺生成量增加，表明Fe³⁺被GSH还原为Fe²⁺。释放的GOx仍保持酶活性，可催化葡萄糖产生H₂O₂；生成的Fe²⁺与H₂O₂通过芬顿反应产生•OH，导致MB吸光度明显降低。前药激活实验显示，单独的H₂O₂或前药不能引起DNA损伤，而H₂O₂+前药或葡萄糖+G–P组可导致明显DNA交联，证明前药需经H₂O₂激活才能释放活性氮芥。

细胞摄取实验中，HeLa和HT1080细胞对FBSA@MOF@HA的摄取荧光强度显著高于LO-2细胞，流式细胞术定量分析显示CD44高表达细胞的荧光强度是LO-2的2–4倍；去除HA后HeLa和HT1080细胞摄取减少，而LO-2不受影响，证实HA介导的肿瘤靶向性。细胞毒性实验中，MOF本身对HT1080细胞毒性极低，GOX@MOF@HA的毒性高于GOX@MOF，G–P@MOF@HA在所有组中细胞毒性最强，而GOX@MOF@HA+游离前药组的毒性低于G–P@MOF@HA，说明原位H₂O₂生成能提高前药激活效率。在HeLa细胞中趋势相似，对LO-2细胞无明显毒性。铁死亡抑制剂VC、DFO、Fer-1和GSH均显著削弱GOX@MOF@HA的细胞毒性，而铁死亡促进剂glu增强其毒性，证明铁死亡是主要细胞死亡机制之一。GOX@MOF@HA处理24小时后HT1080细胞内GSH水平降至约20%。CLSM显示GOX@MOF@HA组的ROS和LPO荧光显著增强。流式细胞术显示G–P@MOF@HA处理组凋亡细胞比例达65.0%，高于G–P@MOF的17.0%。Western blot显示GOX@MOF@HA和G–P@MOF@HA处理的HT1080及HeLa细胞GPX4表达明显降低。体内实验中，PBS和MOF组肿瘤抑制不明显，GOX@MOF@HA单药组表现出一定抗肿瘤活性，G–P@MOF@HA联合治疗组肿瘤抑制效果最强，肿瘤体积和重量均显著小于其他组。H&E染色显示G–P@MOF@HA组肿瘤组织破坏最严重，TUNEL染色阳性细胞最多。肿瘤组织GPX4表达在GOX@MOF@HA和G–P@MOF@HA组显著降低。各组小鼠体重无显著差异，主要器官H&E染色未见明显异常；血液学和肝肾功能指标均在正常范围内；溶血实验显示1 mg/mL浓度下无显著溶血；Cy5标记BSA@MOF@HA的血液循环时间较游离蛋白明显延长。

四、结论与价值

本研究成功构建了HA修饰的GSH响应性铁基MOF纳米平台G–P@MOF@HA，将GOx与H₂O₂敏感氮芥前药通过“可逆点击”化学形成复合物并包载其中。该平台通过HA靶向CD44过表达肿瘤细胞，在肿瘤细胞内高浓度GSH触发下MOF解体，释放GOx和前药，同时Fe³⁺被还原为Fe²⁺；GOx催化葡萄糖产生H₂O₂，促进前药激活释放氮芥进行化疗，同时Fe²⁺与H₂O₂发生芬顿反应产生•OH，引起脂质过氧化和铁死亡。该平台实现了肿瘤靶向递送、原位级联激活和协同铁死亡–化疗，在体外和体内均显著优于单药治疗，且系统毒性低、生物相容性良好。该研究为未来癌症治疗提供了一种更高效、更精准的策略，并可拓展至其他肿瘤类型或联合其他治疗药物。

五、研究亮点

第一，通过GOx与苯硼酸修饰氮芥前药的“可逆点击”化学偶联，实现了酶与前药的一体化递送，并利用原位生成的H₂O₂高效激活前药；第二，铁基MOF同时作为铁源和载体，GSH响应解体后生成Fe²⁺并与GOx产生的H₂O₂协同放大芬顿反应，强化铁死亡；第三，HA修饰赋予纳米平台主动靶向CD44过表达肿瘤细胞的能力，提高肿瘤选择性内吞和疗效；第四，该级联反应纳米平台在体内外均展现出协同铁死亡–化疗的显著抗肿瘤效果，同时保持良好生物安全性和较长血液循环时间。