本研究由来自加拿大麦克马斯特大学（McMaster University）生物化学与生物医学科学系及生物界面研究所的Amal Mathai、Monsur Ali、Yingfu Li和John D. Brennan等人完成，发表于Angewandte Chemie International Edition（2026年，DOI: 10.1002/anie.3766984）。

研究背景

病毒RNA的快速、灵敏检测对于传染病诊断和疫情防控至关重要。目前临床金标准是逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR），但其依赖RNA提取、热循环和荧光检测设备，难以满足即时检测（point-of-care, POC）的需求。等温扩增技术（如LAMP、RPA和SDA）虽然简化了温度控制，但仍常需逆转录、辅助酶处理或荧光读数。滚环扩增（rolling circle amplification, RCA）利用φ29 DNA聚合酶（φ29 DP）在室温下即可产生长单链DNA串联重复产物，具有独特的POC应用潜力。然而，传统RCA产物分子量过大，难以直接在侧流层析装置（lateral flow device, LFD）上迁移和捕获。此前将RCA与LFD偶联的方法往往依赖限制性内切酶切割、标记引物或额外酶处理，增加了体系的复杂性。因此，本研究旨在开发一种无需加热、无需逆转录、无需荧光仪器的高灵敏病毒RNA侧流检测平台，并验证其在临床唾液样本中的诊断性能。

研究流程

研究的第一阶段是构建指数滚环扩增（exponential RCA, e-RCA）反馈系统。作者设计了一种具有自互补区域的环状DNA模板（circular DNA template, CDT），该区域可结合二级引物延伸产物（p2 extension products, p2EPs），通过φ29 DP的3′→5′核酸外切酶活性切除p2EP的3′突出端，产生截短的p2EP（tp2EP），即反馈引物p3。p3可与原始引物p1一样启动新一轮RCA，从而形成指数扩增回路。作者首先通过荧光动力学实验比较了含4、5、8、10个互补碱基对的CDT系统。结果显示，仅含4或5个互补碱基对的非自互补CDT不能支持指数扩增，而含8或10个互补碱基对的自互补CDT（CDT c和CDT d）在30分钟内即可使检测限（limit of detection, LOD）低于500阿摩尔（am）。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（dPAGE）证实了p2EP梯带的形成，且自互补CDT系统的条带强度显著增强。天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（nPAGE）和荧光实验进一步证明p2EP能够结合CDT并引发次级RCA，而φ29 DP处理可产生p3反馈引物。背景信号研究显示，自互补CDT与真实p2组合在约20～30分钟后出现序列依赖性背景扩增，但在10分钟扩增窗口内未观察到可测背景。

第二阶段是设计e-RCA与LFD的偶联策略。作者构建了一个由toehold链（toehold strand, TH）和桥接DNA（bridging DNA, b-DNA）组成的双链复合物。RCA产物（primary RCA products, prCAP）和p2EP可与TH的暴露toehold区域结合，通过toehold介导的链置换（toehold-mediated strand displacement, TMSD）释放b-DNA。释放的b-DNA一端与金纳米颗粒上的测试DNA（test-line DNA, TL-DNA）杂交，另一端与固定在测试线上的DNA（TG-DNA）结合，从而形成可见条带。无关的对照组DNA（CG-DNA和CL-DNA）则形成独立的质控线。作者以SARS-CoV-2基因组RNA中nsp12、nsp13和nsp14区域的三个大片段结构化RNA靶标（分别命名为LS1208、LS1805和LS1583，对应系统1至3）为模型。nPAGE实验证实mrcap1（系统1的单体重复单元）能特异性触发TMSD并释放b-DNA，而乱序对照mrcapJ不能。在50%稀释的SARS-CoV-2阴性唾液中进行的RNase I辅助RCA（RI-RCA）实验表明，只有在RNase I存在时，产生的prCAP1才能有效释放b-DNA。此外，十二烷基硫酸钠（SDS）可抑制φ29 DP的核酸外切酶活性，防止b-DNA降解。LFD条件优化显示，TH–b双链体的最佳用量为15 pmol，过高会导致钩状效应（hook effect）并降低测试线强度。

第三阶段是RI-RCA与LFD的完整偶联及灵敏度评价。在缓冲液和50%唾液中，线性RCA耦合LFD的检测限约为50皮摩尔（pm），而e-RCA方法在仅10分钟扩增后即可达到500 am的检测限，灵敏度提高了五个数量级。对比实验表明，传统准指数RCA（quasi-exponential RCA, QE-RCA）使用非自互补CDT时，LFD检测限仅为约50 pm，与线性RCA相当，证明自互补CDT驱动的反馈机制是高灵敏LFD检测的关键。

第四阶段是临床样本检测条件的优化。作者使用SARS-CoV-2阳性和阴性患者唾液样本，逐步优化了e-RCA反应时间、蛋白酶K（proteinase K, PK）孵育时间、RCA反应体积和唾液输入体积。最优条件为：2.5 μL唾液经PK处理15分钟、蛋白酶K抑制剂（proteinase K inhibitor, PKI）灭活，RNase I/CDT孵育5分钟，e-RCA扩增10分钟，取10 μL反应混合液与TH–b孵育5分钟，LFD读取10分钟，总检测时间约45分钟。该方法无需加热灭活步骤。

第五阶段是临床验证。作者检测了20份RT-qPCR确认的SARS-CoV-2阳性唾液和20份阴性唾液，并用三个检测系统（系统1至3）分别评估。结果显示，三个系统的灵敏度为95%～100%，特异性为100%，总体准确率为95%～100%。受试者工作特征曲线（ROC）下面积（AUC）为1.00，Youden指数（J）在0.95至1.00之间。与传统PK+加热处理方案相比，PKI替代方案性能略低但仍较优。与商业化BTNX COVID-19抗原快速检测相比，RI-e-RCA–LFD分析在20份子样本（10阳10阴）中正确识别了所有阳性样本，而抗原检测仅识别出2份阳性。特异性实验中，OC43、229E和NL63三种常见人类冠状病毒均未产生可检测信号。作者还验证了此前报道的DNAzyme/反义寡核苷酸（ASO）辅助RCA策略与TMSD-LFD读出的兼容性，针对nsp8区域的系统4在临床验证中实现了100%的准确率。

主要结果与结论

本研究成功建立了RNase I辅助引物生成、自互补CDT驱动的指数RCA反馈放大、TMSD介导的b-DNA释放以及LFD视觉读出的完整检测平台。在临床唾液样本中，该平台实现了约45分钟内的95%～100%诊断准确率，检测限达500 am（约相当于196拷贝/μL），且无需加热、逆转录或荧光仪器。e-RCA机制的关键在于单一辅助引物p2延伸后经φ29 DP加工为反馈引物p3，从而建立真正的指数扩增。该体系与DNAzyme/ASO辅助引物生成策略兼容，显示出模块化扩展潜力。

研究价值与亮点

本研究的科学价值在于提出了一种新的指数RCA机制，仅用一个额外引物即可实现反馈驱动的指数扩增，简化了传统指数RCA的设计复杂性。应用价值在于将高灵敏的RCA扩增与无需仪器的LFD读出成功结合，为资源有限环境下的病毒RNA即时检测提供了可行方案。工作流程中的关键创新包括：自互补CDT设计使p2EP经φ29 DP外切酶加工产生p3反馈引物；TMSD模块将大分子RCA产物转化为可迁移的短b-DNA链；SDS淬灭策略同时实现酶灭活和b-DNA保护。这些设计共同解决了RCA产物在LFD上迁移困难的核心瓶颈，使RCA-LFD偶联的灵敏度较传统方法提高五个数量级，并显著缩短了扩增时间。此外，该平台对多种SARS-CoV-2变异株均显示出稳健的检测能力，提示其在不同病毒株和不同靶标RNA的适应性方面具有良好通用性。