肺癌中昼夜节律紊乱的分子机制及临床价值：单细胞转录组学揭示的新发现

作者及发表信息
本研究由华中科技大学同济医学院附属同济医院输血科Lei He、生物化学与分子生物学系Yixian Fan等团队合作完成，通讯作者为Jianghan大学的Fahu Yuan和华中科技大学的Chao Cheng。研究成果于2022年4月12日发表在*Journal of Pineal Research*（DOI: 10.1111/jpi.12803），标题为《Single‐cell transcriptomic analysis reveals circadian rhythm disruption associated with poor prognosis and drug‐resistance in lung adenocarcinoma》。

学术背景

研究领域：肺癌（尤其是肺腺癌，LUAD）的肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）与昼夜节律（Circadian Rhythm）的交互作用。
研究动机：尽管已知昼夜节律紊乱（Circadian Rhythm Disruption, CRD）与肿瘤增殖相关，但其在肺癌临床预后预测中的作用机制尚不明确。既往研究多基于群体水平的转录组数据，忽略了单细胞水平的异质性。本研究旨在通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）揭示CRD在肺癌恶性细胞中的分子特征及其对治疗抵抗的影响。
科学问题：CRD如何通过代谢重编程和免疫微环境重塑促进肺癌进展？能否基于CRD特征开发预后预测模型？

研究流程与方法

1. 数据收集与预处理

• 数据来源：整合3个公共scRNA-seq数据集（GSE123904、GSE131907、PRJNA591860），涵盖30例LUAD患者（原发灶17例、转移灶10例、化疗后3例）的96,024个细胞。
  
• 质量控制：过滤低表达基因（<200基因/细胞），使用Seurat v4.0进行标准化和批次校正（Canonical Correlation Analysis, CCA）。
  
• 细胞分群：通过UMAP聚类鉴定23个细胞亚群，包括恶性细胞、免疫细胞（T细胞、B细胞、巨噬细胞等）、成纤维细胞和内皮细胞。
  

2. CRD评分系统开发

• 算法构建：开发开源R包crdscore，基于358个昼夜节律相关基因（Circadian-Related Genes, CRGs）的表达谱计算CRDscore。
  
  • 步骤：
    
  1. 基因表达标准化（TPM或log2转换）；
     
  2. 随机采样生成背景信号；
     
  3. 通过中心化矩阵计算CRGs与随机基因集的差异得分。
     
• 阈值设定：单细胞水平以75%分位数、群体水平以中位数划分CRDhigh与CRDlow。
  

3. 功能分析与验证

• 代谢与免疫分析：
  
  • 代谢通路：CRDhigh恶性细胞中糖酵解（Glycolysis）、上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）通路激活。
    
  • 免疫微环境：CellPhoneDB分析显示CRDhigh细胞通过分泌CCL5、CXCL16等趋化因子促进T细胞耗竭（T cell exhaustion）。
    
• 临床验证：
  
  • TCGA队列：CRDhigh与低免疫评分（ESTIMATE）、高肿瘤纯度相关，且预后更差（HR=1.72, p<0.001）。
    
  • 免疫治疗预测：基于23个CRGs构建模型（CRGM），在14个独立队列中预测免疫检查点抑制剂（ICB）疗效（AUC=0.75-0.89）。
    

4. 实验验证

• 细胞实验：
  
  • 昼夜节律基因敲除：siRNA沉默核心节律基因CLOCK后，H1299细胞侵袭能力下降（Transwell实验）。
    
  • 褪黑素处理：0.1 mM褪黑素显著降低CRDscore及EMT标志物（Snail、Twist）表达。
    

主要结果

1. CRD与肿瘤恶性程度正相关：转移灶中CRDscore显著高于原发灶（p<0.01），且与EMT、血管生成通路激活相关。
   
2. CRD驱动治疗抵抗：
   
   • TKI耐药患者中CRDhigh细胞比例更高（p<0.05），且富集氧化磷酸化（OXPHOS）和自噬通路。
     
   • 化疗耐药队列（GSE42127）中CRDhigh患者5年生存率仅为CRDlow的1/2。
     
3. 免疫微环境重塑：CRDhigh肿瘤通过上调PD-L1、LAG3等抑制性分子，减少CD8+ T细胞浸润。
   

结论与价值

科学意义：
- 首次在单细胞水平揭示CRD通过代谢重编程（糖酵解/OXPHOS切换）和免疫逃逸（T细胞耗竭）促进肺癌进展。
- 提出CRDscore作为LUAD预后和免疫治疗响应的新型生物标志物。

应用价值：
- 临床预测：CRGM模型可优化ICB治疗患者筛选。
- 治疗策略：靶向CRD（如褪黑素）或可逆转耐药性。

研究亮点

1. 技术创新：开发crdscore算法，实现单细胞CRD量化。
   
2. 跨尺度验证：结合scRNA-seq、TCGA队列和体外实验，多维度验证结论。
   
3. 转化潜力：CRGM模型在多种癌症（如黑色素瘤、膀胱癌）中展现普适性预测能力。
   

其他重要发现

• 时钟样突变特征：虽然与预后无关，但与CRD协同加剧肿瘤异质性（p=0.03）。
  
• 褪黑素的治疗潜力：通过下调Snail抑制EMT，为联合治疗提供新思路。
  

（注：全文术语首次出现均标注英文，如“昼夜节律（Circadian Rhythm）”）