金属-多酚网络包被的R612F纳米颗粒通过抑制应激颗粒降低肝细胞癌耐药性研究报道
本文旨在介绍一篇于2024年发表在 Cell Death Discovery 期刊上的原创性研究论文。该研究由北京大学基础医学院生物化学与分子生物学系、北京大学医学部北京蛋白质修饰与细胞功能重点实验室的Yue Zhou, Tongjia Zhang, Shujie Wang, Zitao Jiao, Kejia Lu, Xinyi Liu, Hui Li, Wei Jiang以及通讯作者Xiaowei Zhang等学者共同完成。此外，合作单位还包括中国医学科学院肿瘤医院山西医院/山西医科大学附属肿瘤医院。本研究获得国家自然科学基金等项目支持。
一、 学术背景
本研究属于肿瘤生物学与纳米医学交叉领域，聚焦于肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma， HCC）治疗中面临的棘手问题——索拉非尼（Sorafenib）耐药。索拉非尼是多激酶抑制剂，是目前晚期HCC的一线治疗药物，但耐药性普遍发生，严重影响疗效。
研究的科学起点在于应激颗粒（Stress Granules, SGs）。应激颗粒是细胞在应对环境压力（如氧化应激、饥饿、药物刺激等）时，在细胞质中形成的无膜致密结构，主要由停滞的翻译起始前复合物、RNA结合蛋白等构成。近年研究发现，应激颗粒在多种癌症中高表达，并与肿瘤进展和化疗耐药密切相关。例如，索拉非尼本身就是一个强有力的应激颗粒诱导剂，而应激颗粒的形成又会促进HCC细胞对索拉非尼产生抵抗。因此，探索应激颗粒形成的机制，并开发靶向干预策略，对于克服HCC耐药具有重要意义。
先前研究表明，I类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）是应激颗粒形成的驱动因素之一，但其具体由哪个亚型调控尚不明确。PI3K包含催化亚基（p110）和调节亚基（p85），其中p110α是其关键催化亚型，在多种癌症中频繁突变，与细胞生存、增殖密切相关。另一方面，蛋白质精氨酸甲基转移酶1（Protein Arginine Methyltransferase 1, PRMT1）催化产生的非对称二甲基化（Asymmetric Dimethylarginine, ADMA）是调控应激颗粒动态的重要翻译后修饰（PTM），它能通过甲基化G3BP1等应激颗粒核心蛋白来调节其组装。PRMT1在酒精性肝损伤和HCC发展中是一个保护性因子。
基于以上背景，本研究旨在阐明：1）PI3K催化亚基p110α在HCC细胞应激颗粒形成中的具体作用和分子机制；2）p110α的甲基化修饰（特别是PRMT1介导的甲基化）如何影响其促应激颗粒功能；3）能否利用纳米技术构建一种新型药物递送系统，通过模拟并维持p110α的高甲基化状态来抑制应激颗粒，从而克服HCC对索拉非尼的耐药性。
二、 研究流程详述
本研究包含了一系列严密的体外和体内实验，流程可概括为以下几个主要阶段：
阶段一：确认p110α参与应激颗粒组装并探索其分子机制。 * 研究对象与样本量： 使用了HCC细胞系（HepG2和Huh7）及人胚肾细胞系（HEK293T）。每个体外实验通常进行至少3次独立重复。 * 实验与处理： 1. 关联性分析： 利用TCGA公共数据库分析HCC患者中p110α基因（PIK3CA）与应激颗粒核心蛋白G3BP1基因表达的相关性（Pearson检验）。 2. 相互作用验证： * 免疫共沉淀（Co-IP）： 在HEK293T细胞中共转染Flag-p110α和HA-G3BP1质粒，或检测HepG2细胞中内源性p110α与G3BP1的相互作用。 * 免疫荧光共定位： 使用多种化学刺激（亚砷酸钠、山梨醇、过氧化氢、氯化钠）诱导HepG2和Huh7细胞产生应激颗粒，通过双标免疫荧光观察p110α与G3BP1在应激颗粒中的共定位情况。 3. 功能验证： * 过表达与敲低： 在HepG2/Huh7细胞中过表达或利用慢病毒介导的shRNA敲低p110α，然后用上述四种化学刺激诱导应激颗粒。以G3BP1和另一个应激颗粒标志物eIF4G作为指示，通过免疫荧光定量计算带有应激颗粒的细胞比例。 * 应激恢复实验： 观察p110α过表达或敲低后，在去除亚砷酸钠刺激的条件下应激颗粒解聚的动力学变化。 4. 机制探究： * 信号通路检测： 通过Western Blot检测不同应激条件下，p110α、p85α、磷酸化Akt（p-Akt）以及应激颗粒形成标志性事件——真核起始因子2α磷酸化（p-eIF2α）的蛋白水平变化。 * 蛋白互作网络分析： 通过Co-IP检测p110α过表达或敲低对G3BP1与其他应激颗粒成分（如RNA结合蛋白PABP、核糖体大亚基蛋白RPL4、小亚基蛋白RPS6）之间相互作用的影响。并设置了RNase A、金属螯合剂EDTA/EGTA（破坏核糖体稳定性）和Mg²⁺（稳定核糖体）处理组，以判断相互作用是否依赖RNA或特定的核糖体状态。 * 结构域定位： 构建了一系列p110α结构域缺失突变体（ΔABD, ΔRBD, ΔC2, ΔHelical, ΔKinase）。通过Co-IP分析确定哪个结构域负责与应激颗粒蛋白结合；通过免疫荧光实验验证该结构域缺失对应激颗粒组装的影响。
阶段二：揭示PRMT1介导的p110α甲基化修饰及其对应激颗粒的调控作用。 * 研究对象： HepG2、Huh7和HEK293T细胞。 * 实验与处理： 1. PRMT1与PI3K通路关联： 在细胞中过表达PRMT1或其酶活缺失突变体G98R，检测对PI3K/Akt通路（p-Akt水平）的影响。 2. 相互作用验证： 通过Co-IP（外源及内源）和GST Pull-down实验，确认PRMT1与p110α（而非p85α）的直接相互作用。免疫荧光观察两者在细胞内的共定位。 3. 体外甲基化实验： 纯化His-PRMT1和GST-p110α蛋白，在甲基转移酶缓冲体系中孵育，使用抗ADMA抗体检测p110α是否被PRMT1非对称二甲基化。 4. 甲基化位点鉴定： 分析p110α序列，发现其螺旋结构域内存在一个RG基序（R612-G613）。将R612位点突变为丙氨酸（R612A）。通过Co-IP实验验证R612A突变体是否能被PRMT1甲基化，从而确定R612为关键甲基化位点。 5. 甲基化对应激颗粒功能的影响： * 共转染PRMT1与野生型p110α或R612A突变体，通过免疫荧光观察PRMT1过表达对两者促应激颗粒能力的影响。 * 利用CRISPR/Cas9技术敲除PRMT1，观察在PRMT1缺失背景下，p110α和R612A促应激颗粒能力的变化。 * 通过Co-IP结合ADMA检测，分析PRMT1过表达或敲除对p110α与应激颗粒成分（G3BP1、PABP、RPL4、RPS6）结合能力的影响。
阶段三：设计并构建模拟p110α持续甲基化的纳米颗粒（MPN-R612F），评估其克服索拉非尼耐药的效果。 * 研究策略创新： 基于前述发现，研究团队构思了一种新型治疗策略：构建一个能模拟p110α持续甲基化状态的纳米递送系统，以抑制应激颗粒，从而克服耐药。他们设计了一个“正电荷/苯丙氨酸”（Arg/Phe）突变体R612F，用苯丙氨酸（Phe）替换精氨酸（Arg）。因为Phe具有与甲基化精氨酸相似的疏水性侧链，可以模拟精氨酸持续甲基化的构象效应。Western Blot证实R612F本身就能呈现高甲基化信号。 * 纳米颗粒构建（方法创新）： * 组成与原理： 采用金属-多酚网络（Metal-Polyphenol Network， MPN）包被技术。MPN是一种由金属离子和多酚化合物通过配位作用自组装形成的纳米材料，具有制备简单、生物相容性好、多功能载药和刺激响应（如pH响应）等优点。 * 制备流程： 首先，通过静电作用将带正电的聚乙烯亚胺（Polyethylenimine， PEI）与带负电的R612F质粒DNA复合，形成PEI-R612F复合物（直径约40 nm）。然后，依次加入Fe³⁺和从绿茶中提取的天然多酚——单宁酸（Tannic Acid），在PEI-R612F表面通过Fe³⁺与单宁酸的配位作用自组装形成MPN涂层，最终得到MPN-R612F纳米颗粒（直径约65 nm）。通过添加EDTA（破坏配位键）、尿素（破坏氢键）、NaCl（破坏静电作用）和Tween 20（破坏疏水作用）验证了MPN的形成主要依赖配位键。 * 体外功能评估： 1. 细胞毒性： MTT实验比较MPN-R612F、PEI-R612F、空载体纳米颗粒等对HepG2细胞活力的影响。 2. 溶酶体逃逸能力（方法创新）： 用荧光探针标记R612F质粒，制备荧光标记的MPN-R612F和PEI-R612F。在不同时间点（1, 2, 4, 8小时）用其处理HepG2细胞，并用LysoTracker Red标记溶酶体，Hoechst 33342标记细胞核。通过共聚焦显微镜观察荧光质粒与溶酶体的共定位情况，评估纳米颗粒避免被溶酶体降解的“逃逸”能力。 3. 抑制应激颗粒形成： 免疫荧光实验评估MPN-R612F和PEI-R612F处理对应激颗粒诱导的抑制效果。 4. 协同索拉非尼效果： MTT实验评估MPN-R612F单独使用、与索拉非尼联用对HepG2细胞活力的影响。 * 体内药效评估： * 动物模型： 使用雌性BALB/c裸鼠构建HepG2细胞皮下移植瘤模型。 * 实验分组与处理： 当肿瘤体积达到50 mm³时，将小鼠随机分为5组（每组5只）：PBS对照组、MPN-空载体组、MPN-R612F组、索拉非尼组、MPN-R612F + 索拉非尼联合治疗组。通过尾静脉注射给予相应治疗（第10、15、20天）。 * 观察指标： 监测30天内肿瘤体积和重量的变化。实验结束后，取肿瘤组织进行免疫组化染色，检测细胞增殖标志物Ki67的表达水平。同时取肝脏和肾脏组织进行H&E染色，评估纳米颗粒的生物安全性。
三、 主要研究结果详述
结果一：p110α是应激颗粒组装的关键调节因子，其螺旋结构域介导了与应激颗粒成分的相互作用。 * TCGA数据分析显示，在HCC患者中，p110α与G3BP1的表达呈显著正相关。Co-IP实验证实了p110α（而非p85α）在体内外均能与G3BP1直接结合。 * 免疫荧光显示，在四种不同化学刺激下，p110α均与G3BP1在应激颗粒中共定位。Western Blot表明应激刺激激活了下游Akt信号（p-Akt增加），但不改变p110α本身蛋白水平。 * p110α过表达显著促进应激颗粒形成并延迟其解聚，而敲低p110α则显著抑制应激颗粒组装。这表明p110α是应激颗粒动态的核心调节器。 * p110α不影响G3BP1、PABP等应激颗粒蛋白的表达水平，但能增强p-eIF2α水平，并显著增强G3BP1与PABP、RPL4、RPS6之间的相互作用。这种增强作用对于G3BP1-PABP是RNA依赖的，而对于G3BP1-RPL4/RPS6是RNA非依赖的。 * 进一步研究发现，p110α本身也能直接结合G3BP1、PABP、RPL4和RPS6。重要的是，p110α与RPL4/RPS6的结合在EDTA/EGTA解离的核糖体亚基中增强，在Mg²⁺稳定的完整80S核糖体中消失，表明p110α直接结合核糖体蛋白，而非rRNA。 * 通过结构域缺失突变体筛选，发现螺旋结构域（Helical domain） 的缺失完全阻断了p110α与所有测试的应激颗粒/核糖体蛋白的结合，并且δHelical突变体显著抑制应激颗粒形成。这确证了螺旋结构域是p110α发挥促应激颗粒功能所必需的结构基础。
结果二：PRMT1在R612位点甲基化p110α，从而抑制其促应激颗粒功能。 * PRMT1过表达抑制PI3K/Akt通路活性（p-Akt降低），而酶活缺失突变体G98R无此效应，提示PRMT1通过其酶活性影响该通路。 * Co-IP和Pull-down实验证实PRMT1特异性与p110α相互作用，而与p85α无关。免疫荧光显示两者在细胞质共定位。 * 体外甲基化实验明确证明PRMT1能使p110α发生非对称二甲基化（ADMA）。 * 将p110α的R612位点突变为丙氨酸（R612A）后，其甲基化完全消失，证实R612是PRMT1催化p110α甲基化的关键位点。 * 功能上，PRMT1过表达能抑制野生型p110α的促应激颗粒能力，但对R612A突变体无影响；反之，PRMT1敲除则增强野生型p110α的促应激颗粒能力，对R612A无影响。这表明PRMT1通过甲基化p110α的R612位点来负调控其功能。 * 机制上，PRMT1敲除增强了p110α与G3BP1、PABP、RPL4、RPS6的结合，同时p110α的ADMA信号消失；而PRMT1过表达则抑制这些结合并伴随p110α ADMA信号增强。这证明PRMT1介导的R612甲基化直接干扰了p110α与应激颗粒成分的招募和结合。
结果三：索拉非尼治疗降低p110α甲基化水平，而模拟持续甲基化的MPN-R612F纳米颗粒能有效抑制应激颗粒并增强索拉非尼疗效。 * 实验证实索拉非尼处理能诱导HepG2和Huh7细胞产生应激颗粒，同时降低PRMT1蛋白水平和p110α的甲基化水平。这提示索拉非尼耐药可能与p110α低甲基化导致的应激颗粒过度形成有关。 * R612F突变体成功模拟了持续甲基化状态，在无PRMT1的情况下也能呈现高ADMA信号。 * 成功构建了MPN-R612F纳米颗粒。表征显示其为球形，粒径均一。MTT实验表明MPN-R612F比PEI-R612F对HepG2细胞具有更强的杀伤力。 * 溶酶体逃逸实验是关键发现之一：与PEI-R612F相比，MPN-R612F处理的细胞中，荧光质粒能更快、更有效地从溶酶体中逃逸，并在8小时后大量进入细胞核，而PEI-R612F组则观察到明显的溶酶体捕获和荧光降解。这证明了MPN涂层赋予了纳米颗粒更优越的溶酶体逃逸能力，提高了基因递送效率。 * 免疫荧光证实MPN-R612F比PEI-R612F能更显著地抑制化学刺激诱导的应激颗粒形成。 * 联合治疗显示强大协同效应：体外MTT实验显示，MPN-R612F与索拉非尼联用对HepG2细胞的杀伤效果显著优于二者单独使用。 * 体内实验验证治疗潜力：在荷瘤裸鼠模型中，MPN-R612F联合索拉非尼治疗组显示出最强的肿瘤生长抑制效果，肿瘤重量最小，肿瘤组织Ki67阳性增殖细胞比例最低。同时，各治疗组（包括联合治疗组）小鼠的肝脏和肾脏未出现明显病理损伤，表明MPN-R612F具有良好的生物安全性。
四、 研究结论与意义
本研究系统性地揭示了p110α/PRMT1/甲基化轴在调控肝细胞癌应激颗粒形成和索拉非尼耐药中的关键作用，并据此开发了一种创新的纳米联合治疗策略。
核心结论： 1. 机制层面： PI3K催化亚基p110α（而非调节亚基p85α）通过其螺旋结构域与应激颗粒核心蛋白G3BP1、核糖体蛋白等相互作用，促进应激颗粒组装，是HCC细胞应激颗粒形成的关键调节因子。 2. 翻译后修饰调控层面： PRMT1能在p110α螺旋结构域的R612位点（RG基序）催化非对称二甲基化。这种甲基化修饰会干扰p110α与应激颗粒成分的结合，从而负向调控p110α的促应激颗粒功能。索拉非尼治疗会降低p110α的甲基化水平，这可能部分解释了其诱导耐药的原因。 3. 转化应用层面： 基于上述机制，成功构建了模拟p110α持续高甲基化状态的R612F突变体，并利用先进的金属-多酚网络（MPN）包被技术，开发了高效、低毒、具有优异溶酶体逃逸能力的MPN-R612F纳米颗粒。该纳米颗粒能有效抑制HCC细胞应激颗粒的形成，与索拉非尼联用时，在体外和体内均表现出强大的协同抗肿瘤效应，为克服HCC索拉非尼耐药提供了全新的解决方案。
研究价值： * 科学价值： 首次阐明了p110α特异性调控应激颗粒组装的分子机制，并发现了PRMT1介导的R612甲基化是精细调控这一过程的关键“分子开关”。这深化了对于PI3K信号通路非经典功能、蛋白质精氨酸甲基化在肿瘤应激适应中作用的理解，为肿瘤生物学领域增添了新的知识。 * 应用价值： 研究提出的“靶向p110α甲基化以抑制应激颗粒克服耐药”的策略具有高度的创新性和转化潜力。所构建的MPN-R612F纳米递送系统，不仅验证了该策略的可行性，更展示了纳米材料（特别是MPN）在实现高效、靶向基因治疗方面的优势。这种联合治疗方案为临床治疗晚期、耐药的肝细胞癌提供了新的思路和候选方案。
五、 研究亮点
六、 其他有价值的讨论
论文在讨论部分还展望了应激颗粒在肿瘤微环境（如低糖、高ROS、缺氧）适应、肿瘤代谢重编程以及癌基因表达调控中的潜在更广泛作用。研究者指出，本研究主要聚焦于应激颗粒在介导化疗耐药方面的作用，而应激颗粒是否作为蛋白质保护性“储库”，帮助肿瘤细胞快速适应微环境需求，仍有待未来探索。这为后续研究指明了方向，即全面评估应激颗粒在HCC进展中的多维角色。此外，研究构建的MPN纳米平台具有多功能修饰潜力，也为其他基于核酸或蛋白质的肿瘤靶向治疗提供了可借鉴的技术框架。