本研究由 A. Gala Morena、Arnau Bassegoda、Javier Hoyo 和 Tzanko Tzanov 等人完成，通讯作者为 Tzanko Tzanov，研究团队隶属于西班牙加泰罗尼亚理工大学化学工程系分子与工业生物技术组。该研究于2021年3月23日发表在 ACS Applied Materials & Interfaces 期刊上，论文标题为“Hybrid Tellurium−Lignin Nanoparticles with Enhanced Antibacterial Properties”。
一、研究背景与目的
抗生素耐药性（antimicrobial resistance, AMR）已成为全球公共卫生的重大威胁。由于抗生素的过度使用，细菌在选择性压力下不断产生耐药菌株，导致常规抗生素治疗效果下降，感染病程延长甚至导致死亡。据预测，到2050年，全球每年因耐药菌感染导致的死亡人数可能达到1000万。因此，开发能够避免或延缓耐药机制产生的新型抗菌剂成为迫切需求。
金属及类金属纳米颗粒（nanoparticles, NPs）因其不同于传统抗生素的多靶点抗菌机制而受到关注。这类纳米颗粒可同时破坏细菌细胞膜、诱导氧化损伤、抑制代谢酶活性，从而降低细菌产生耐药性的可能。银纳米颗粒是目前研究最广泛的抗菌金属纳米颗粒，但已有研究发现细菌对银纳米颗粒也能产生耐药性，因此需要拓展新型抗菌纳米材料的种类。
碲（tellurium, Te）是一种类金属元素，其含氧酸根离子——亚碲酸根离子（TeO₃²⁻）对革兰氏阴性菌具有已知的毒性。近年来，碲纳米颗粒（TeNPs）作为抗菌材料逐渐受到关注。然而，传统理化合成方法中使用的有毒还原剂对人体细胞具有细胞毒性且对环境有害。为了克服这些限制，已有研究尝试利用微生物或植物来源的还原剂进行绿色合成，但这些方法往往需要复杂的提取纯化过程，且可能与食品和医疗行业竞争资源。
本研究首次使用工业木质素（kraft lignin）作为还原剂，通过超声化学法（sonochemical approach）绿色合成碲−木质素杂化纳米颗粒（TeLigNPs）。木质素是地球上第二丰富的生物聚合物，但在高分子形式下极少被高值化利用，通常仅作为燃料燃烧。木质素含有丰富的酚羟基和脂肪族羟基，具备还原能力，同时还可作为纳米颗粒的结构基质。本研究旨在开发一种安全、环保的碲基纳米抗菌材料，并系统评价其对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌活性、作用机制及对人细胞的生物相容性。
二、研究流程与实验方法
研究流程可分为四个主要阶段：TeLigNPs的合成与表征、抗菌活性评价、生物相容性评价以及抗菌机制研究。
在合成阶段，研究者将Protobind 6000无硫硫酸盐木质素分散于水中（1% w/v），通过加入NaOH将pH调至9以增加木质素溶解度。然后向该木质素溶液中加入亚碲酸钠粉末，使其终浓度为100 mM。将所得混合溶液在20 kHz、50%振幅的超声场中于60 °C处理30分钟。超声处理后，通过25 000g离心30分钟纯化生成的纳米颗粒，并用超纯水洗涤以完全去除未反应的亚碲酸根离子。随后将沉淀重悬于超纯水中，采用低强度超声使纳米颗粒完全分散，最后通过500g离心10分钟去除较大颗粒和未溶解的木质素。
在表征阶段，研究者利用透射电子显微镜（TEM）观察TeLigNPs的形貌和尺寸分布，使用ImageJ软件统计纳米颗粒粒径。通过高分辨TEM（HR-TEM）分析纳米颗粒中的晶体结构，并利用能量色散X射线光谱（EDX）进行元素分析。采用高角环形暗场扫描透射电子显微镜（HAADF-STEM）获取碲和氧的元素分布图。纳米颗粒的ζ电位使用Zetasizer Nano Z测定。碲含量通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）定量，样品在分析前经20%（v/v）硝酸于100 °C消解1小时，稀释至2%硝酸浓度后过滤。
在抗菌活性评价阶段，研究者选择了革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, ATCC 25923）和革兰氏阴性菌大肠杆菌（Escherichia coli, ATCC 25922）及铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, ATCC 10145）作为测试菌株。采用连续稀释法测定TeLigNPs的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC），碲含量范围为0.04至2.39 ppm。细菌过夜培养物稀释至OD₆₀₀=0.01（约10⁵–10⁶ CFU·mL⁻¹），与不同浓度的TeLigNPs在96孔板中37 °C振荡孵育24小时，通过测定OD₆₀₀计算生长抑制率。同时，通过平板计数法测定存活细菌数，计算对数减少值（log reduction）和减少百分比。杀菌动力学实验则将细菌与不同浓度TeLigNPs（碲含量2.39、1.20和0.60 ppm）混合后在37 °C、230 rpm振荡条件下孵育，在不同时间点取样，采用滴板法计数存活菌落。
在生物相容性评价阶段，研究者使用人成纤维细胞（BJ-5ta）和人角质形成细胞（HaCaT）作为细胞模型。细胞以每孔60 000个的密度接种于96孔板中，培养24小时后加入不同浓度的TeLigNPs继续孵育24小时。移除纳米颗粒后，细胞在新鲜培养基中恢复24小时，然后使用AlamarBlue试剂检测细胞代谢活性，计算细胞活力百分比。此外，使用活/死细胞染色试剂盒进行荧光显微镜观察，活细胞被染为绿色，死细胞被染为红色。
在抗菌机制研究阶段，研究者进行了三项实验。第一，活性氧（reactive oxygen species, ROS）检测：细菌或人细胞暴露于TeLigNPs（碲含量2.39 ppm）30分钟后，加入氧化敏感探针H₂DCFDA（2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯）孵育30分钟，测定荧光强度以评价ROS生成水平。第二，细菌超微结构观察：将TeLigNPs与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌于37 °C振荡孵育2小时后，经戊二醛和多聚甲醛固定、四氧化锇后固定、乙酸铀酰染色、乙醇梯度脱水和Spurr树脂包埋，制备超薄切片，用TEM观察细菌细胞形态变化。第三，革兰氏阴性菌模型膜相互作用研究：将磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰甘油（PG）以8:2（v/v）比例混合于氯仿中，在Langmuir槽中形成单分子层膜，压缩至表面压力33 mN·m⁻¹（相当于天然细菌膜的侧向表面压力）。稳定后，将TeLigNPs注入膜下亚相中，记录表面压力随时间的变化，以评价纳米颗粒对细菌模型膜的扰动能力。
三、主要研究结果
合成与表征结果显示，超声处理后木质素−亚碲酸盐混合液颜色变深，表明亚碲酸根被还原为元素碲（Te⁰）。所得TeLigNPs带负电荷，ζ电位为−32.7 mV，平均粒径为182±85 nm。TEM图像显示，纳米颗粒由无定形基质和嵌入其中的多个电子致密球形团簇组成。HR-TEM显示这些团簇内存在清晰的晶体畴。元素分布图表明，碲元素主要定位于电子致密团簇中，而氧元素的高强度信号分布在无定形基质中，证实该基质为富含甲氧基和羟基的木质素。这些结果证明，在超声化学合成过程中，木质素不仅作为还原剂参与碲的还原，还作为纳米颗粒的结构基质包埋了碲团簇。
抗菌活性评价结果显示，碲含量为2.39 ppm的TeLigNPs能够完全抑制大肠杆菌和铜绿假单胞菌的生长，但对金黄色葡萄球菌仅实现13%的生长抑制。MIC测定表明，TeLigNPs对大肠杆菌和铜绿假单胞菌的MIC分别为0.07 ppm和2.39 ppm（以碲含量计）。相比之下，相同碲浓度的亚碲酸盐对这些革兰氏阴性菌没有抑制效果，亚碲酸盐对大肠杆菌和铜绿假单胞菌的MIC分别为0.31 ppm和15.60 ppm。这说明将碲纳米化为TeLigNPs后，其抗菌活性显著增强。在杀菌效果方面，2.39 ppm的TeLigNPs对大肠杆菌实现了100%的杀灭（6.54 log减少），对铜绿假单胞菌实现了99.9995%的杀灭（5.42 log减少）。杀菌动力学实验表明，2.39 ppm和1.20 ppm的TeLigNPs在4小时内对大肠杆菌表现出杀菌作用，并在24小时内实现完全清除。对铜绿假单胞菌，2.39 ppm的TeLigNPs在6小时内实现杀菌效果（5.7 log减少），并在24小时后维持；而较低浓度仅表现出抑菌作用，细菌在4小时后出现恢复生长。TEM超微结构分析显示，未处理的大肠杆菌细胞表面光滑、胞质电子致密；经TeLigNPs处理后的大肠杆菌出现胞质完整性丧失、细胞包膜破坏和胞内内容物聚集等损伤迹象。而金黄色葡萄球菌暴露于TeLigNPs后未出现形态学变化。
生物相容性评价结果显示，在抗菌测试浓度范围内（碲含量0.07至2.39 ppm），人角质形成细胞和成纤维细胞的细胞活力与未处理细胞相比没有降低。只有当TeLigNPs浓度提高到抗菌浓度的8倍（19.12 ppm）时，才观察到细胞毒性效应。荧光显微镜观察也证实，在抗菌浓度下，两种人细胞系的形态未发生改变。
抗菌机制研究结果显示，TeLigNPs与大肠杆菌和铜绿假单胞菌孵育后，H₂DCFDA探针的荧光强度显著增加，表明革兰氏阴性菌细胞内产生了ROS。而金黄色葡萄球菌暴露于TeLigNPs后未检测到荧光增加，与其较低的抗菌敏感性一致。在人角质形成细胞和成纤维细胞中，TeLigNPs未诱导ROS产生。Langmuir膜实验表明，将TeLigNPs注入革兰氏阴性菌模型膜下方后，表面压力上升，说明纳米颗粒具有膜扰动能力，这种表面活性归因于木质素组分。
基于以上结果，研究者提出TeLigNPs对革兰氏阴性菌的杀菌机制假设：TeLigNPs的表面活性使其能够结合并插入革兰氏阴性菌的外膜脂质双层中；插入后，TeLigNPs产生的ROS引发膜脂质过氧化，生成的脂质过氧化物分解为高反应性短链醛，扩散至胞质中氧化蛋白质的巯基和氨基，破坏多种细胞代谢过程，最终导致细胞死亡。而革兰氏阳性菌具有厚的肽聚糖细胞壁，能够阻止TeLigNPs接近细胞膜，因此对其抗菌活性较低。
四、研究结论与意义
本研究成功开发了一种基于工业木质素的超声化学绿色合成方法，制备了新型杂化碲−木质素纳米颗粒TeLigNPs。木质素在该合成中不仅充当亚碲酸根的还原剂，还作为纳米颗粒的结构组分包埋碲团簇，并赋予纳米杂化物表面活性。TeLigNPs在低于亚碲酸盐的碲浓度下即可完全抑制革兰氏阴性菌大肠杆菌和铜绿假单胞菌的生长，并在4–6小时内实现99.9995%以上的杀菌效果。同时，TeLigNPs在抗菌浓度下对人细胞系无细胞毒性，表现出良好的生物相容性。机制研究表明，TeLigNPs通过膜扰动和ROS生成发挥对革兰氏阴性菌的杀菌作用。该研究为环境友好的碲基纳米抗菌材料的开发提供了新策略，TeLigNPs有望成为治疗细菌感染的潜在抗菌剂，未来应进一步开展体内研究以验证其治疗感染性疾病的潜力。
五、研究亮点
本研究的亮点体现在以下几个方面：第一，首次将工业木质素用于碲纳米颗粒的绿色合成，实现了对低值化生物质的高值化利用；第二，采用超声化学法一步合成，无需对起始材料进行化学修饰，工艺简便、快速且环境友好；第三，所制备的TeLigNPs对革兰氏阴性菌表现出强杀菌活性，其效果优于此前报道的缺乏聚合物结构组分的碲纳米颗粒；第四，TeLigNPs在有效抗菌浓度下对人细胞具有良好的生物相容性，体现了安全设计（safe-by-design）的理念；第五，通过多种实验手段系统揭示了TeLigNPs的抗菌机制，包括膜扰动和ROS生成两个关键环节。
六、其他有价值的内容
本研究还通过比较TeLigNPs与游离亚碲酸根离子的MIC，明确了纳米化策略在提高碲抗菌活性方面的优势。此外，研究中使用的Langmuir膜技术为评价纳米颗粒与细菌膜相互作用提供了一种有效的体外模型方法。研究还指出，木质素的表面活性因其来源和纯化工艺不同而有所差异，这为后续优化TeLigNPs的性能提供了方向。