作为pflügers archiv - european journal of physiology期刊于2025年7月24日在线发表的一项原创研究，由Paula Rhana（美国加州大学戴维斯分校生理学与膜生物学系）、Flávia Carvalho Aguiar、Diego Santos Souza（巴西塞尔希培联邦大学生理学系）、Ênio Ferreira Lima（巴西米纳斯吉拉斯联邦大学病理学系）、Andréia Laura Prates Rodrigues（巴西塞尔希培联邦大学生理学系）以及Jader Santos Cruz（巴西米纳斯吉拉斯联邦大学生物化学与免疫学系）共同完成。其中，Andréia Laura Prates Rodrigues和Jader Santos Cruz为共同资深作者。

本研究的学术领域聚焦于癌症生物学与细胞生理学的交叉领域，具体关注电压门控钠离子通道（Voltage-gated Na+ Channels, VGSCs）在肿瘤发生发展中的作用。研究背景源于乳腺癌作为全球女性最常见的癌症，其转移是导致死亡的主要原因。尽管治疗手段不断进步，但耐药性和副作用仍是重大挑战，因此寻找新的治疗靶点至关重要。近年来，离子通道在肿瘤发展关键过程（如增殖、迁移）中的作用使其成为癌症诊疗的新兴靶点。其中，VGSCs传统上被认为在可兴奋细胞中产生动作电位，但也在多种非兴奋性癌细胞（如前列腺癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌）中被发现，并与肿瘤侵袭性增强相关。然而，绝大多数研究关注的是非肿瘤状态或已发生转移的晚期癌细胞，对于癌症早期阶段（原发肿瘤阶段）VGSCs的存在、功能特性及其作用知之甚少。因此，本研究旨在填补这一空白，利用源自人类原发性乳腺癌的细胞系，探究VGSCs在乳腺癌早期发生阶段的生理学角色、其对转移潜能的贡献，并评估其作为新型治疗靶点的潜力。

研究详细工作流程包含五个主要部分：细胞培养、膜片钳电生理记录、细胞增殖与迁移实验、免疫细胞化学分析以及相应的数据分析。研究对象包括两种源自不同原发性人类乳腺癌的细胞系MACL-1和MGS0-3（由巴西米纳斯吉拉斯联邦大学Alfredo M. Góes教授惠赠），以及作为非肿瘤对照的乳腺上皮细胞系MCF-10A。所有细胞均在标准条件下培养。 首先，在电生理学分析中，研究采用全细胞膜片钳技术（whole-cell patch-clamp technique）对上述细胞进行记录。这是一种标准且精确的细胞电活动测量方法。实验使用EPC 10放大器，通过PatchMaster软件进行数据采集与分析。研究者设计了特定的电压协议：将细胞钳制在-50 mV，给予一个150毫秒的超极化预脉冲至-120 mV，然后给予从-90 mV到+60 mV、步长为10 mV的测试脉冲，以激发离子通道电流。为了确认内向电流由钠离子介导，实验设置了细胞外液无钠条件，用N-甲基-D-葡糖胺（NMDG+）替代钠离子。为鉴别VGSCs亚型，研究者应用了河豚毒素（Tetrodotoxin, TTX, 100 nM）这种通道特异性阻断剂进行药理学实验。样本量方面，MACL-1细胞进行了21次记录，MGS0-3细胞进行了20次记录，用于基本特性分析；TTX敏感性实验中，每组细胞（MACL-1和MGS0-3）各进行了7次记录。 其次，在细胞功能学实验中，研究者评估了VGSCs的活性对细胞增殖和迁移的影响。增殖实验采用MTT比色法，将细胞以每孔1×10^4的密度接种于96孔板，分别用TTX（10 µM）或海葵毒素II（Anemone Toxin II, ATX, 100 nM）处理24和48小时。每组处理设置了四个重复孔，实验独立重复了两次。迁移实验则采用经典的划痕愈合（scratch-wound）实验。细胞接种于35毫米培养皿，长满单层后用无菌移液器尖端制造线性划痕。随后在含有1%胎牛血清的培养基中加入TTX（10 µM）或ATX（100 nM），分别在24和48小时后测量划痕宽度变化，并计算迁移指数。迁移实验每组条件进行了4次重复。 第三，在分子表达定位研究中，研究者通过免疫细胞化学技术检测了VGSCs特定亚型（Nav1.5， Nav1.6， Nav1.7）在非肿瘤细胞（MCF-10A）、原发肿瘤细胞（MACL-1， MGS0-3）以及作为阳性对照的转移性乳腺癌细胞（MDA-MB-231）中的表达与亚细胞定位。细胞样本经固定、石蜡包埋后，使用特异性一抗（Nav1.5， Nav1.6， Nav1.7）进行染色，并通过过氧化物酶反应和DAB显色。采用半定量方法，对1000个标记细胞中蛋白在不同细胞区室（如细胞核、细胞质、细胞膜）的定位百分比进行分类统计。 最后，数据分析方面，所有数据均以均值±标准误表示。使用GraphPad Prism 8软件进行统计分析。组间差异采用Student’s t检验或双因素方差分析（Two-way ANOVA）后进行Tukey事后检验进行评估，以P < 0.05为具有统计学显著性差异。

研究的主要结果如下：在电生理学结果部分，膜片钳记录显示，非肿瘤MCF-10A细胞未检测到任何内向钠电流，仅观察到去极化电位下的外向电流（推测为氯通道电流）。相反，两种原发性乳腺癌细胞系MACL-1和MGS0-3均表现出典型的内向电流，该电流在-40 mV阈值激活，并在0 mV附近达到峰值，且具有快速失活的特性，这正是功能性VGSCs的特征。当细胞外液去除钠离子后，该内向电流完全消失，证实了其钠离子依赖性。对两种肿瘤细胞的详细比较发现，它们的钠电流激活特性相似：激活阈值均在-40 mV左右，峰值电流密度接近（MACL-1: -12.7 ± 1.3 pA/pF; MGS0-3: -13.4 ± 2.3 pA/pF）。然而，两者在钠电流失活动力学上存在显著差异：MGS0-3细胞的失活时间常数（τ = 1.1 ± 0.1 ms）明显慢于MACL-1细胞（τ = 0.9 ± 0.1 ms），这表明VGSCs在功能上存在异质性。药理学阻断实验进一步揭示了VGSCs亚型组成的差异：100 nM TTX可完全抑制MACL-1细胞的内向钠电流（峰值电流密度从-14.1 ± 2.5 pA/pF降至2.7 ± 2.3 pA/pF），表明MACL-1细胞仅表达TTX敏感的VGSCs亚型。而在MGS0-3细胞中，100 nM TTX仅抑制了约80%的钠电流（从-15.7 ± 2.9 pA/pF降至-3.2 ± 1.5 pA/pF），提示该细胞系同时表达TTX敏感型和TTX抵抗型VGSCs。这些电生理结果不仅首次证实了功能性VGSCs存在于早期乳腺癌细胞中，还揭示了不同原发肿瘤细胞间VGSCs药理学特性的差异，为后续研究其功能意义提供了基础。 在细胞功能学结果部分，尽管电生理学证实了VGSCs的存在和活性，但药理学干预并未影响细胞的增殖和迁移行为。MTT增殖实验表明，MACL-1和MGS0-3细胞的增殖速率均显著高于MCF-10A细胞，但用TTX或ATX处理24小时或48小时后，两种肿瘤细胞的增殖率均未发生显著改变。同样，划痕愈合实验显示，MCF-10A细胞的迁移能力极低，而两种原发肿瘤细胞则表现出明显的随时间迁移的能力。然而，无论是用TTX阻断VGSCs，还是用ATX增强其活性，对MACL-1和MGS0-3细胞的迁移指数均未产生显著影响。这一结果挑战了VGSCs活性与肿瘤细胞侵袭性行为之间的既定关联，暗示在乳腺癌早期阶段，VGSCs可能并非调控增殖和迁移的关键因子。 在VGSCs亚型表达与定位结果部分，免疫细胞化学分析提供了VGSCs在亚细胞水平分布的详细信息。Nav1.5亚型在几乎所有被检细胞（MCF-10A: 93%， MACL-1: 92%， MGS0-3: 96%）中均有表达，染色主要定位于细胞核区，部分细胞可见核膜染色。值得注意的是，MGS0-3细胞还表现出细胞膜相关的染色，这与电生理实验中观察到的该细胞系对TTX不完全敏感（即存在TTX抵抗型Nav1.5）的结果相吻合。Nav1.6在所有细胞系中均有强烈表达（100%），染色分布于细胞核和细胞质，少数细胞（MCF-10A: 4%， MACL-1: 5%， MGS0-3: 8%）存在细胞膜定位。Nav1.7在所有细胞系中亦呈阳性表达，但表达模式不同：MCF-10A和MACL-1细胞在胞质和核区染色强烈，而MGS0-3细胞的胞质染色较弱，核内标记最少。然而，MGS0-3细胞膜染色比例（5%）高于MCF-10A和MACL-1细胞（2%），且所有细胞系均可见核膜染色。这些结果共同表明，VGSCs不仅在细胞膜上表达，也广泛存在于细胞内区室（特别是细胞核），这提示VGSCs在癌细胞中可能具有超越其经典离子传导功能（如动作电位产生）的非经典角色，可能参与基因表达调控等过程。不同细胞系间表达模式的差异也反映了肿瘤异质性。

本研究的结论是，首次在早期（原发）乳腺癌细胞系中证实了功能性电压门控钠离子通道的存在，并揭示了其异质性（TTX敏感型与抵抗型共存）及独特的失活动力学特征。然而，与晚期转移性乳腺癌细胞中VGSCs促进侵袭性行为的普遍认知不同，本研究发现抑制或增强这些通道的活性并未影响早期乳腺癌细胞的增殖或迁移能力。这挑战了VGSCs在乳腺癌所有阶段均直接驱动肿瘤侵略性的观点，表明其功能可能是阶段依赖性或环境依赖性的。同时，VGSCs在细胞内区室（如细胞核）的显著定位，暗示它们可能作为信号枢纽，通过与非通道蛋白（如β亚基、锚定蛋白）相互作用，参与调控基因表达等非离子转运功能。因此，VGSCs在癌症早期的作用可能更偏向于信号转导而非直接促进细胞运动。

本研究的科学价值与应用意义在于：其一，填补了VGSCs在癌症早期发生阶段研究的空白，将研究视野从晚期转移拓展至肿瘤起始阶段，为理解癌症发展的全过程中离子通道角色的动态变化提供了重要数据。其二，研究结果挑战了VGSCs作为“通用”促癌因子的简单化观点，强调了肿瘤生物学背景（如发展阶段、分子亚型）的重要性，提示针对VGSCs的靶向治疗策略可能需要根据肿瘤分期进行个性化考量。其三，VGSCs在细胞核等非经典位置的表达，开辟了新的研究方向，即探索其在癌细胞中除调控膜电位和离子稳态之外的“非经典”功能，例如通过蛋白互作网络影响转录或细胞周期。其四，研究所使用的MACL-1和MGS0-3细胞系作为早期乳腺癌的模型，为未来研究提供了有价值的工具。

本研究的亮点包括：1. 研究对象新颖：首次系统性研究源自人类原发性乳腺癌（而非转移性）细胞系中的VGSCs，直接聚焦于肿瘤发生的早期阶段。2. 发现具有挑战性：研究结果（VGSCs存在但不影响增殖/迁移）直接挑战了该领域内关于VGSCs普遍促进肿瘤侵袭性的主流假设，推动了更细致、更分阶段的理解。3. 多技术整合：研究综合运用了高精度的膜片钳电生理学、细胞功能学实验（增殖、迁移）以及分子定位技术（免疫细胞化学），从电流特性、功能表达到亚细胞定位等多个层面全面刻画了VGSCs在早期乳腺癌细胞中的状态，证据链条完整。4. 揭示功能异质性：即使在同属早期乳腺癌的两种不同细胞系中，也观察到了VGSCs失活动力学和TTX敏感性的差异，这提示了早期乳腺癌内部的异质性，与临床肿瘤异质性相呼应。5. 提出新假说方向：基于VGSCs的细胞内定位，研究在讨论中合理推测并引出了其可能作为信号分子参与非经典功能的假说，为后续机制研究指明了潜在方向。这些亮点使得本研究不仅是一个观察性报告，更是推动领域内概念深化和范式思考的重要工作。