本文属于类型a，是一篇关于活体光合微针贴片用于黑色素瘤术后治疗与创面愈合的原始研究论文。以下为详细学术报告。

一、研究作者、机构与发表信息

本研究由Jinxuan Jia、Xuhong Guo、Yuwei Wang、Meiling Wu、Xiaocheng Wang、Miaoqing Zhao和Yuanjin Zhao等人合作完成。主要通讯作者为Xiaocheng Wang（中国科学院大学温州研究院，wangxiaocheng@ucas.ac.cn）、Miaoqing Zhao（山东省肿瘤医院，zhaomqsd@163.com）以及Yuanjin Zhao（东南大学，yjzhao@seu.edu.cn）。论文发表于Journal of Nanobiotechnology，2024年第22卷，文章编号698，DOI为10.1186/s12951-024-02982-8，属于开放获取（open access）文章。

二、研究背景与目的

恶性黑色素瘤（malignant melanoma）是最具侵袭性的皮肤癌类型，具有高侵袭性和高转移潜能。预测显示，到2040年，黑色素瘤的发病率将增加50%，死亡率将增加68%。手术切除（surgical excision）仍是黑色素瘤的主要治疗手段，但标准切除边缘往往不足以彻底清除肿瘤组织，约80%的患者术后会出现肿瘤复发或转移。此外，术后形成的大面积皮肤缺损通常难以愈合，易发展为慢性创面（chronic wounds），严重影响患者生活质量。

既往研究已经尝试利用复合水凝胶（composite hydrogels）、纤维膜（fibrous membranes）和生物活性玻璃纳米颗粒（bioactive glass nanoparticles）等双功能创面敷料治疗术后皮肤肿瘤创面。这些策略主要通过光热效应（photothermal effects）杀灭残余肿瘤细胞，同时利用其生物活性促进创面愈合。然而，单一光热效应的敷料难以清除深层残余肿瘤细胞，不能有效防止复发或转移。另外，肿瘤微环境（tumor microenvironment）中的缺氧（hypoxia）状态不仅会促进肿瘤复发和转移，还会延迟创面愈合。因此，亟需开发一种能够同时杀灭肿瘤细胞、缓解缺氧并促进创面愈合的多功能创面敷料。

本研究旨在构建一种负载活体光合微藻（microalgae，MA）和乌贼黑色素（cuttlefish melanin，CM）的活性光合微针贴片（microneedle patch，即MA/CM@MN），用于黑色素瘤术后治疗和皮肤创面修复。该设计利用微藻的光合产氧能力缓解缺氧，并利用乌贼黑色素的光热转换能力进行光热治疗（photothermal therapy，PTT）。

三、研究流程与实验方法

研究流程涵盖了材料制备、表征、体外实验和体内实验等多个环节，以下分步骤详细阐述。

1. 乌贼黑色素纳米颗粒的制备与表征

研究者从食品级鱿鱼墨汁中提取CM，并通过多次离心、过滤和超声分散进行纯化。纯化后的CM纳米颗粒平均水合直径约为205.6 nm，zeta电位为-30.1 mV。颗粒间排斥力使CM在水溶液中可均匀分散超过24小时而不沉淀。扫描电子显微镜（SEM）进一步确认了CM纳米颗粒的粒径和球形形貌。

1. 甲基丙烯酰化透明质酸（HAMA）的合成

研究团队以透明质酸（hyaluronic acid，HA）为原料，在pH 8–9条件下与甲基丙烯酸酐（methacrylic anhydride，MA）反应12小时，随后经透析和冻干制备HAMA。HAMA作为微针基底和针尖的主体水凝胶材料。

1. MA/CM@MN的制备

MA/CM@MN采用模板复制法（template replication method）制备。针尖溶液由HAMA（5% w/v）、聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA，4% w/v）、CM（1 mg/ml）和光引发剂LAP（2‰ w/v）混合而成；基底溶液则由微藻（1×10⁶ cells/ml）分散于10% HAMA溶液中制得。将针尖溶液加入PDMS模具，经真空和离心后紫外照射60秒固化，随后加入基底溶液并再次紫外固化，最终脱模获得MA/CM@MN。所得微针贴片为10×10阵列，位于10×10 mm²基底上，每根针呈圆锥形，底部直径350 μm，高900 μm。针尖因含CM呈深灰色，基底因含微藻呈浅绿色。

1. 体外表征

研究团队利用光学显微镜、荧光显微镜和SEM观察了MA/CM@MN的结构，证实微藻均匀包埋于基底、CM纳米颗粒分散于针尖。光热性能测试采用808 nm激光（0.50 W/cm²，5 min）照射，并通过红外热成像系统实时记录温度变化。结果显示，含CM的微针（CM@MN和MA/CM@MN）温度可在5分钟内迅速升至约55°C，而不含CM的微针（MN和MA@MN）无明显升温。此外，通过改变CM浓度（0、0.25、0.5、1、2 mg/ml）和激光功率（0.30–0.70 W/cm²）验证了光热升温的可控性，并通过5次激光开关循环验证了光热稳定性。

光合产氧能力测试中，将含微藻的微针在LED光照（6000 lx，距离10 cm）下培养7天，并连续监测溶解氧（dissolved oxygen，DO）水平。结果显示，含微藻微针能够在光照下持续释放氧气，且随着微藻体外增殖，氧气释放量随时间增加。

1. 体外细胞实验

研究采用人皮肤成纤维细胞（human skin fibroblasts，HSFs）评价MA/CM@MN的细胞相容性。在常氧条件下，利用活/死细胞染色（live/dead staining）和CCK-8实验检测细胞存活和增殖。结果显示，各组细胞活性均良好，说明微针材料无明显细胞毒性。在缺氧条件（1% O₂）下，含微藻微针在光照下可显著缓解HSFs的细胞缺氧状态，并促进细胞增殖。研究者通过缺氧荧光探针{[Ru(dpp)₃]Cl₂}评估细胞内缺氧情况，结果显示光照下MA@MN和MA/CM@MN组的缺氧细胞明显少于其他组。

体外抗肿瘤实验使用小鼠黑色素瘤B16F10细胞。各微针组经808 nm激光照射15分钟后继续培养，随后通过活/死染色和CCK-8检测细胞活力。结果显示，含CM的微针在近红外照射后细胞死亡率显著升高，CM@MN组和MA/CM@MN组的细胞活力分别降至6.58%和11.01%。进一步实验表明，肿瘤细胞杀伤效果随照射时间和照射次数增加而增强。

1. 体内动物实验

动物实验采用C57BL/6雄性小鼠（5–6周龄）建立B16F10荷瘤模型。当肿瘤体积达到约100 mm³时，在肿瘤部位制造直径10 mm的全层皮肤创面，并切除约90%的肿瘤组织，模拟不完全切除术后状态。随后将MN、CM@MN或MA/CM@MN贴片覆盖于创面，并施加808 nm激光（0.50 W/cm²，15 min），连续照射3天。肿瘤体积计算公式为V = LW²/2，其中L为最长径，W为最短径。第3天取部分小鼠肿瘤组织进行免疫荧光染色，包括Ki67（细胞增殖标志物）、TUNEL（凋亡检测）和HIF-1α（组织缺氧标志物）染色；第12天处死其余小鼠，取肿瘤组织进行HE染色和组织学分析。

四、主要结果与数据支持

1. 结构表征结果

SEM图像显示，MA/CM@MN的针尖和基底分别清晰包埋了CM纳米颗粒和微藻，而空白微针表面光滑平整。荧光图像证实针尖（蓝色荧光）与基底（绿色荧光）分离清晰，证明了模板复制法能够实现功能分区。

1. 光热性能结果

实时红外热像显示，含CM微针在808 nm激光照射5分钟内迅速升温并稳定在约55°C。温度随CM浓度和激光功率增加而升高。在5次激光开关循环后，光热效应保持稳定，说明CM赋予微针良好的光热稳定性和可控升温能力。

1. 光合产氧能力结果

含微藻微针在光照培养7天后，微藻数量显著增加，甚至在MA/CM@MN＋NIR组（第1天和第3天接受近红外照射）也保持增殖能力。这表明微藻能够在HAMA基质中存活并增殖，不受CM掺入和短时近红外照射的影响。DO监测显示光照下氧气持续释放，且随培养时间延长释放量增加。

1. 细胞相容性与抗缺氧结果

在常氧条件下，各组HSFs均保持高存活率，CCK-8结果显示CM和微藻的掺入无明显细胞毒性，甚至可能有促进皮肤细胞增殖的作用。MA/CM@MN＋NIR组在前3天细胞活力略低于其他组，但第5天与对照组无明显差异，说明短时近红外照射不会产生长期不良影响。在缺氧条件下，含微藻微针在光照下可显著降低细胞缺氧水平，并促进细胞增殖。CM@MN＋NIR组的细胞活力在缺氧条件下也明显下降，提示其具有肿瘤杀伤潜力。

1. 体外抗肿瘤结果

活/死细胞染色显示，CM@MN和MA/CM@MN组在近红外照射后出现显著细胞死亡，而对照组、MN组和MA@MN组细胞存活良好。定量分析显示，CM@MN＋NIR组和MA/CM@MN＋NIR组的细胞活力分别为6.58%和11.01%，显著低于其他组。MA/CM@MN组细胞活力低于CM@MN组，可能因为微藻光合产生的氧气进一步增强了杀伤效果。细胞活力随照射时间和次数增加而降低，证实了光热治疗的可控性和有效性。

1. 体内抗肿瘤与创面愈合结果

在体内实验中，CM@MN＋NIR和MA/CM@MN＋NIR组的肿瘤在第12天时显著缩小，创面逐渐愈合；而对照组、MN＋NIR组和MA/CM@MN组创面难以愈合且肿瘤持续扩大。HE染色显示，CM@MN＋NIR组创面虽愈合，但新生组织旁可见肿瘤细胞结节，提示局部复发；而MA/CM@MN＋NIR组无肿瘤结节，表明其能有效防止复发并实现长期抑制。

免疫荧光分析显示，Ki67染色表明含CM微针在近红外照射下能显著抑制肿瘤细胞增殖。TUNEL染色显示CM@MN＋NIR和MA/CM@MN＋NIR组细胞凋亡率约为35%，显著高于其他组。HIF-1α染色显示，MA/CM@MN组（8.51%）和MA/CM@MN＋NIR组（0.84%）的HIF-1α表达水平显著低于对照组（40.48%）、MN＋NIR组（38.29%）和CM@MN＋NIR组（29.49%），说明含微藻微针能有效缓解肿瘤缺氧微环境。

五、结论与研究意义

本研究成功构建了一种负载活体光合微藻和乌贼黑色素纳米颗粒的活性光合微针贴片MA/CM@MN，用于黑色素瘤术后治疗和皮肤创面愈合。该微针贴片具有活微藻负载的基底和CM负载的针尖，前者在光照下光合产氧，可促进皮肤细胞增殖并保护细胞免受缺氧诱导的死亡；后者在近红外照射下有效升温，对黑色素瘤细胞产生强杀伤作用。在体内不完全肿瘤切除模型中，近红外照射的MA/CM@MN能够有效防止局部肿瘤复发，并同时促进肿瘤诱导创面的愈合。组织学分析进一步揭示，MA/CM@MN可抑制肿瘤细胞增殖、触发肿瘤细胞凋亡并缓解组织缺氧。

该研究的科学价值在于提出了一种集活体生物产氧与光热治疗于一体的多功能微针设计，实现了功能分区和协同治疗。与传统敷料相比，微针贴片可通过微尺度针尖无痛、无创地穿透皮肤屏障，提高治疗剂递送效率。更重要的是，基底与针尖的功能分离有效避免了光热升温过程对微藻活性的损伤，保证了持续产氧能力。

在应用价值方面，该微针贴片为术后黑色素瘤患者提供了一种简便、有效的局部治疗策略，有望在临床上用于术后创面护理，减少复发和转移风险，加速创面愈合，改善患者预后。此外，该设计思路也可拓展至其他缺氧相关疾病和术后肿瘤治疗场景。

六、研究亮点

1. 创新性地将活体光合微藻整合入微针基底，实现原位持续产氧，缓解肿瘤缺氧微环境并促进创面愈合。
2. 利用乌贼黑色素纳米颗粒作为天然光热转换材料，赋予微针针尖高效的近红外光热治疗能力。
3. 通过微针基底与针尖的功能分区设计，避免了光热治疗对微藻活性的热损伤，保持了微藻的增殖和产氧能力。
4. 体内实验证实该微针不仅可有效清除残余肿瘤细胞，还能防止肿瘤复发，并促进创面愈合，展现出良好的术后综合治疗效果。

七、其他有价值内容

研究还讨论了微针贴片相对于传统复合水凝胶的优势。虽然水凝胶可同时负载微藻和CM，但微针贴片通过针尖穿刺可绕过皮肤屏障，提高治疗剂的生物利用度；同时，功能分区设计可减少光热治疗对微藻的热损伤，维持其长期产氧能力。此外，作者指出，已有研究表明黑色素能够调节创面局部免疫微环境，恢复巨噬细胞表型并清除过量活性氧，因此CM在针尖中可能不仅发挥光热治疗作用，还可能促进创面愈合。作者还提到，未来研究中可考虑将光热激活的免疫治疗剂与微针贴片结合，以进一步增强对残余肿瘤细胞的免疫应答，降低转移风险。