本研究由来自浙江中医药大学生命科学学院、杭州优鼎生物技术有限公司及温州医科大学附属第一医院泌尿外科等多机构的研究团队完成。第一作者为Cong Shi和Jianglei Xu（共同第一作者），通讯作者为Chunyu Jin、Zhixian Yu和Xiaobing Dou。该论文发表于*Clinical Epigenetics*期刊，2025年刊出，题为“Novel DNA methylation biomarkers in urine for non-invasive diagnosis of bladder urothelial carcinoma”。

膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma, BLCA）约占所有膀胱癌的90%，是一种具有高侵袭性和高复发率的常见恶性肿瘤。当前临床诊断的金标准为膀胱镜检查，但该方法具有侵入性，限制了其在筛查和监测中的广泛应用；尿脱落细胞学检查虽无创，但对低级别肿瘤的敏感性较低。因此，寻找无创、经济且高灵敏度的早期BLCA检测方法具有重要的临床需求。已有研究表明，DNA甲基化异常在肿瘤发生的早期即可出现，并且可以在尿液等体液中检测到，因而基于尿液的DNA甲基化标志物检测被认为是一种有前景的BLCA无创早期诊断策略。然而，目前经过验证的BLCA甲基化标志物数量有限，不同研究间同一标志物的结果存在差异，且缺乏高质量的前瞻性临床验证。本研究旨在从公共数据库中筛选并验证新的BLCA尿液DNA甲基化标志物，并与已知标志物进行比较，进一步构建多位点组合检测模型，以提高BLCA的无创诊断性能。

研究整体流程可分为发现阶段、临床样本验证阶段和组合模型构建与验证阶段。在发现阶段，研究者利用DiseaseMeth 2.0数据库中BLCA的甲基化数据筛选候选基因。筛选标准包括：病例组与对照组平均甲基化水平差值≥0.25，病例组与对照组平均甲基化水平比值≥2，对照组平均甲基化水平≤0.15，且显著性P值≤1e-10。根据这些标准共筛选出19个候选基因及其对应的CpG岛区域。随后，研究者设计甲基化特异性引物和探针，在膀胱癌细胞系UMUC3及正常尿液样本的亚硫酸氢盐转化DNA中进行验证。最终，从19个候选基因中筛选出三个新标志物，即HIST1H3J、NKX2-4和YBX3P1；这三个基因在膀胱癌细胞中甲基化水平高，在正常尿液中甲基化水平低，且两种样本之间的检测差异显著。同时，研究纳入了六个已报道并应用的BLCA甲基化标志物，包括ONECUT2、OTX1、POU4F2、SOX1、TWIST1和VIM，用于检测和对比分析。

在临床样本验证阶段，研究共收集了319例尿液样本，其中180例来自BLCA患者，139例来自非BLCA患者。样本来自2023年2月至12月在浙江大学医学院附属第一医院怀疑患有BLCA的患者，所有尿液样本均在膀胱镜检查或手术前采集，采集后立即离心分离尿沉渣并保存于−20°C。样本被分为训练集和测试集：训练集包括171例样本（97例BLCA和74例非BLCA），测试集包括148例样本（83例BLCA和65例非BLCA）。非BLCA组包括膀胱炎、尿路结石和良性前列腺增生等良性疾病患者，以及部分其他泌尿生殖系统肿瘤（如前列腺癌和肾癌）患者。所有样本均提取基因组DNA并进行亚硫酸氢盐转化，随后采用实时定量甲基化特异性PCR（real-time quantitative methylation-specific PCR, qMSP）检测各标志物的甲基化水平。qMSP使用ACTB基因作为内参，该基因不受甲基化状态影响；若ACTB的Cp值大于33，则该反应视为无效。各靶基因的甲基化水平以靶基因与ACTB的Cp差值（ΔCp）表示，ΔCp值越低表示甲基化水平越高。

在数据分析流程中，首先比较了9个甲基化标志物在BLCA组和非BLCA组之间的ΔCp差异。结果显示，与非BLCA组相比，所有9个标志物在BLCA尿液样本中的ΔCp值均显著降低，表明这些基因在BLCA中均存在显著的高甲基化，支持它们作为BLCA肿瘤标志物的潜力。进一步将BLCA患者分为低级别和高级别亚组进行分层分析，结果显示所有标志物在非BLCA与不同级别BLCA之间均有显著差异（P<0.01）；其中OTX1、YBX3P1、VIM和TWIST1在低级别和高级别BLCA之间有显著差异（P<0.05）。这表明这些标志物不仅可用于BLCA的检测，部分标志物还可能用于肿瘤风险分层。

随后，研究利用训练集样本评估各单一标志物的诊断效能。基于ROC曲线分析，根据约登指数确定各标志物的最佳阈值，并计算相应的敏感性、特异性和准确性。结果显示，三个新标志物HIST1H3J、NKX2-4和YBX3P1的曲线下面积（AUC）分别为0.892、0.914和0.871，准确率分别为84.80%、85.38%和81.29%。六个已知标志物的AUC范围为0.850至0.939，准确率范围为81.87%至88.30%。其中，已知标志物ONECUT2具有最大的单基因AUC值（0.939）。这些结果表明，新发现的标志物具有与已知标志物相当的临床检测性能。

为了进一步提高诊断性能，研究采用逻辑回归分析构建多基因组合模型。首先以单基因AUC最大的ONECUT2为基础，与其他基因进行两两组合分析。结果显示，ONECUT2与SOX1的组合具有最大的AUC（0.960）。随后进一步分析最佳三基因和四基因组合，发现随着标志物数量的增加，AUC逐步提高。最终，由ONECUT2、SOX1、TWIST1和NKX2-4组成的四基因组合在训练集中实现了AUC 0.971，敏感性为92.78%，特异性为94.59%，准确率为92.39%。该四基因组合的逻辑回归模型公式为：logit(p) = 7.17963 − 0.17753 × NKX2-4_ΔCp − 0.40667 × ONECUT2_ΔCp − 0.1754 × SOX1_ΔCp − 0.22215 × TWIST1_ΔCp。当logit(p)≥0时判定为阳性，时判定为阴性。该模型在包含148例样本的测试集中进行了验证，结果显示AUC为0.967，准确率为91.22%，提示该四基因组合检测在独立测试集中仍保持了良好的诊断性能。此外，四基因组合对高级别BLCA的敏感性高于低级别BLCA，这与分层分析中高级别BLCA的ΔCp值更低、甲基化水平更高的结果一致。

本研究的结论是，研究团队发现并验证了三个新的BLCA尿液DNA甲基化标志物（HIST1H3J、NKX2-4和YBX3P1），并构建了一个包含一个新标志物和三个已知标志物的四基因诊断组合（ONECUT2、SOX1、TWIST1和NKX2-4）。该组合在初步验证中表现出较高的敏感性和特异性，具有用于BLCA早期无创检测的良好临床潜力。研究为BLCA提供了新的DNA甲基化标志物，并提出了基于尿液的多基因甲基化检测panel用于非侵入性临床诊断。

本研究的亮点在于：发现了三个此前未在BLCA中报道的DNA甲基化标志物，并通过与已知标志物的对比证明了其临床性能；采用qMSP技术对临床尿液样本进行检测，验证了标志物在低级别和高级别BLCA中的检出能力；通过逻辑回归构建多基因组合模型，显著提高了诊断性能；并利用独立的测试集对模型进行了前瞻性验证。此外，研究还通过分层分析揭示了部分标志物在低级别和高级别BLCA之间的甲基化差异，提示其可能用于肿瘤风险分层。

研究的局限性主要包括：样本量相对较小，可能影响结果的普遍性；研究主要集中于特定地区和特定人群，结果的广泛适用性有待更大队列和多中心研究进一步验证；尿液中可能混有血细胞等其他污染细胞，血尿作为膀胱癌常见症状可能干扰基于尿液的DNA甲基化检测的准确性；此外，样本中高级别BLCA比例较高，可能导致总体敏感性偏高。未来需要扩大样本量并开展多中心研究以系统评估这些标志物在真实世界中的诊断性能。