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该研究由Yipeng Fang、Yunfei Zhang、Chenxi Jia、Chunhong Ren、Xutao Zhao和Xin Zhang等人完成，主要作者来自汕头大学医学院第一附属医院分子心脏病学实验室、医学分子影像实验室以及汕头大学医学院，合作单位还包括天津大学天津医院和济南市中医医院。通讯作者为Xin Zhang。该研究于2023年2月27日发表在期刊《Frontiers in Pharmacology》上。

本研究属于糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）治疗领域的药理学研究。糖尿病肾病是糖尿病最常见的并发症之一，在中国成年人糖尿病患病率高达11.2%，其中约20%–40%的患者会发展为糖尿病肾病，并已成为慢性肾脏病和终末期肾病的主要原因。足细胞（podocyte）损伤在糖尿病肾病的发生发展中起关键作用，足细胞功能障碍、脱落和凋亡是导致蛋白尿（proteinuria）的重要原因，而持续性蛋白尿又会加速肾脏疾病的进展。因此，足细胞被认为是糖尿病肾病治疗的潜在靶点。目前临床上主要使用血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素受体阻滞剂来减少蛋白尿，但能否阻止终末期肾病的进展仍不确定。尿毒清颗粒（niaoduqing granules）是一种由九味中药组成的复方制剂，常用于治疗终末期肾病，已有研究表明其能通过调控MAPK/NF-κB信号通路改善肾功能、抑制肾纤维化并减轻炎症反应。然而，尿毒清颗粒对早期糖尿病肾病足细胞损伤的保护作用及其机制尚不明确。本研究旨在通过网络药理学（network pharmacology）方法和实验验证，探索尿毒清颗粒治疗糖尿病肾病足细胞损伤和蛋白尿的药理机制。

研究的工作流程可分为两大部分：网络药理学分析和体外实验验证。在网络药理学分析中，首先从中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP筛选尿毒清颗粒九味药材的活性成分，筛选条件为口服生物利用度≥30%且类药性≥0.18，共获得206个活性成分，其中142个成分从TCMSP数据库获得预测靶点，133个成分从Swiss Target Prediction网站获得靶点信息，最终删除重复后共鉴定出1022个预测靶点。同时，从GEO数据库获取三个与糖尿病肾病相关的数据集GSE1009、GSE96804和GSE111154，按照|log FC|≥1且p值<0.05的标准筛选差异表达基因，分别得到1325、574和115个差异表达基因。此外，从GeneCards、OMIM、NCBI、TTD、DisGeNET和PharmGKB等公共数据库收集糖尿病肾病、蛋白尿和足细胞损伤相关的疾病靶点。将至少在两个数据库或数据集中出现的重叠靶点定义为疾病相关靶点，最终获得986个糖尿病肾病相关靶点、213个蛋白尿相关靶点和2074个足细胞损伤相关靶点。将尿毒清预测靶点与上述三类疾病靶点取交集后，获得16个潜在治疗靶点。随后，利用Cytoscape 3.6.1构建“药材-成分-治疗靶点”网络，发现槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）和山柰酚（kaempferol）具有最高的拓扑参数，被确定为核心活性成分。进一步将16个潜在治疗靶点导入STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络，并通过Cytoscape的CytoNCA插件计算节点度值、中介中心性和紧密中心性三个拓扑参数，筛选出7个核心靶点，分别为VEGFA、NOS3、ICAM1、PTGS2、ACE、SPP1和REN。基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析显示，AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中是最显著富集的信号通路，此外还富集了肾素-血管紧张素系统、HIF-1信号通路、VEGF信号通路、TNF信号通路和PI3K-Akt信号通路等。分子对接分析中，前五个核心成分与前七个核心靶点进行了对接，所有对接结合能均小于-5.5 kcal/mol，其中槲皮素与PTGS2的结合能最低，为-9.3 kcal/mol。

在体外实验验证部分，由于尿毒清颗粒粗提液对MPC5小鼠足细胞具有明显的细胞毒性，因此研究者采用三种主要活性成分槲皮素、木犀草素和山柰酚按1:1:1比例混合作为替代药物。首先通过CCK-8实验评估细胞毒性，结果显示该混合物在最高4 μg/ml浓度下无显著细胞毒性，因此选择1 μg/ml作为安全浓度用于后续实验。将MPC5细胞分为对照（control）组、药物处理（que+lut+kae）组、高糖（high glucose, HG）组和高糖加药物处理（HG+que+lut+kae）组，高糖条件为44 mM葡萄糖。通过实时定量PCR（RT-qPCR）检测预测核心靶点的mRNA表达水平，结果显示高糖暴露显著上调VEGF-α、PTGS-2、ICAM-1和ACE的表达，而药物处理可显著减弱这种上调作用；REN、SPP-1和NOS-3的表达在高糖条件下无显著变化。通过Western blot检测AGE-RAGE信号通路的活性，结果显示高糖组PI3KCA和NF-κB的磷酸化水平以及RAGE、TNF-α、TGF-β1和COL1A1的mRNA水平显著升高，药物处理可显著降低NF-κB磷酸化水平及RAGE、TNF-α、TGF-β1和COL1A1的表达；虽然药物处理也抑制了PI3KCA和AKT的磷酸化，但未达到统计学显著性。通过流式细胞术和Western blot检测细胞凋亡，结果显示药物处理可显著降低高糖诱导的MPC5细胞凋亡率，高糖组Bax和cleaved-caspase-3蛋白水平显著升高，而药物处理可显著降低这两种蛋白的表达水平。

研究结果表明，尿毒清颗粒可能通过多成分、多靶点、多通路的方式保护糖尿病肾病中的足细胞损伤。网络药理学分析鉴定出16个潜在治疗靶点，其中VEGFA、ICAM1、PTGS2和ACE在体外实验中得到了验证。KEGG富集分析显示AGE-RAGE信号通路是最关键的信号通路，实验验证表明尿毒清颗粒的活性成分能显著抑制高糖诱导的AGE-RAGE信号通路激活，并抑制VEGF-A、ICAM-1、PTGS-2和ACE的过表达，同时减轻足细胞凋亡和纤维化相关因子的表达。该研究的结论是：尿毒清颗粒可能通过调控AGE/RAGE信号通路的活性及多个基因的表达来保护糖尿病肾病中的足细胞损伤，槲皮素、木犀草素和山柰酚是主要的活性成分，VEGFA、ICAM1、PTGS2和ACE可能是其主要靶点。该研究的科学价值在于首次系统性地通过网络药理学和实验验证揭示了尿毒清颗粒治疗早期糖尿病肾病足细胞损伤的潜在分子机制，为中药复方“多成分、多靶点、多通路”治疗复杂性疾病的理念提供了实证支持。在应用价值方面，该研究为将尿毒清颗粒拓展应用于早期糖尿病肾病的临床治疗提供了理论依据，也为蛋白尿的控制和足细胞保护提供了新的思路。研究的亮点包括：将网络药理学预测与体外实验验证相结合，系统性地筛选并确认了尿毒清颗粒的核心活性成分和靶点；发现AGE-RAGE信号通路在尿毒清颗粒保护足细胞中的关键作用；以及利用三种纯化活性成分替代粗提物进行体外实验，解决了中药粗提物细胞毒性问题。此外，研究中还讨论了多种与糖尿病肾病治疗相关的其他药物，如ACEI、ARB、SGLT-2抑制剂和DPP-4抑制剂等，并指出了这些药物与尿毒清颗粒在抗纤维化机制上的异同。研究也存在一些局限性，包括三种纯化成分能否完全代表尿毒清颗粒复方尚不清楚、缺乏动物实验验证以及仅关注了排名靠前的预测靶点和通路等。