一种创新的药物发现新范式：库对库筛选技术识别小分子-蛋白质相互作用及其抗癌应用研究

本文旨在向广大研究人员介绍一项于2016年发表在《ACS Combinatorial Science》期刊上的开创性研究。该研究由美国加州大学戴维斯分校医学院生物化学与分子医学系Kit S. Lam教授领衔的团队完成，题目为“Rapid Discovery of Functional Small Molecule Ligands Against Proteomic Targets Through Library-Against-Library Screening”。本研究属于化学生物学与药物发现交叉领域，提出并验证了一种全新的高通量筛选策略，旨在同步解决药物发现中的两大核心挑战：识别“可成药”靶点（“druggable” targets）和发现与之对应的治疗性小分子配体。

一、 研究背景与目标 在传统药物发现流程中，针对单一靶点筛选庞大化合物库（“一靶对多库”）或利用单一化合物探针筛选蛋白质/基因库（“一探针对多库”）是主流策略。然而，这些方法效率有限，难以揭示海量潜在的小分子-蛋白质相互作用。本研究团队长期致力于“一珠一化合物”（One-Bead-One-Compound， OBOC）组合化学库技术，该技术可在单个微珠上合成并呈现单一化合物，从而构建包含海量成员的化合物库用于筛选。另一方面，噬菌体展示cDNA表达蛋白质组（phage display cDNA expression proteome）库技术则能将细胞中表达的蛋白质片段展示在噬菌体表面，用于识别与特定探针结合的靶蛋白。

本研究旨在将这两种强大的高通量技术相结合，创建一个“库对库”（Library-Against-Library）筛选平台。其核心目标是：1）直接、大规模地平行探索小分子化合物库与蛋白质组片段库之间（高达约10^13种可能的相互作用）的相互作用对；2）快速鉴定出具有高亲和力和特异性的小分子-蛋白质结构域结合对；3）从这些结合对中，发现具有生物活性（特别是抗癌活性）的小分子先导化合物及其作用靶点，从而为药物研发提供新的线索和工具。

二、 研究详细工作流程 本研究的工作流程复杂而系统，主要包括以下几个关键步骤：

步骤一：OBOC小分子库的构建与优化 研究团队首先设计并合成了一个三组分（三个多样性位点R1， R2， R3）的苯并咪唑类小分子OBOC库。该库的理论多样性为16，896种化合物（24种R1胺类构件 × 22种R2醛类构件 × 32种R3酸/异氰酸酯构件）。库的合成采用了“分-合”（Split-and-Mix）组合化学策略，并使用了一种称为“地形分隔双层珠”（topographically segregated bilayer beads）的特殊载体。其创新之处在于：1）在微珠表面呈现小分子化合物，用于与噬菌体库相互作用；2）在微珠内部通过可切割的接头（cleavable linkers）连接一套独特的“编码标签阶梯”（coding tag ladders）。这些编码标签的分子量组合，可唯一对应微珠表面小分子的化学结构（即R1， R2， R3的构成），为后续的“化学解码”奠定了基础。为了减少筛选中的假阳性和多价效应，团队特意采用了“低取代”（down-substituted）策略，降低了微珠表面小分子的密度，以增加筛选的严谨性。

步骤二：M13噬菌体展示cDNA库与OBOC库的“库对库”筛选 筛选使用的探针是一个商业化的M13噬菌体展示Jurkat T细胞cDNA表达文库。筛选过程采用了团队之前开发的两步酶联比色法，并进行了关键改进以适应库对库筛选。具体流程如下： 1. 预筛选与背景扣除：将约10万个OBOC库微珠与M13噬菌体抗体和酶标二抗孵育，然后加入碱性磷酸酶（AP）的底物BCIP。任何因非特异性结合抗体而显色（蓝绿色）的微珠，都被记录为“假阳性”背景珠。此步骤的图像被记录下来。 2. 库对库孵育：将微珠与大量（约10^9 CFU）M13噬菌体cDNA文库孵育，使展示在噬菌体表面的蛋白质片段有机会与微珠上的小分子结合。 3. 阳性结合检测：洗去未结合的噬菌体后，再次依次加入抗M13抗体和酶标二抗，最后将微珠包埋于琼脂糖中并加入BCIP底物。通过与噬菌体结合而被“标记”上抗体-酶复合物的微珠会显色。 4. 图像分析与阳性珠挑取：通过计算机软件，将孵育噬菌体库后（步骤3）的图像减去预筛选（步骤1）的背景图像，精准定位出仅因结合噬菌体而显色的“真阳性”微珠。通过这种方式，高效地从海量微珠中筛选出91个与噬菌体文库有强相互作用的阳性小分子珠。

步骤三：小分子结构的化学解码 从阳性珠中回收与噬菌体结合的蛋白质并不可行，但团队巧妙地通过解码微珠内部的化学标签来确定其表面小分子的结构。具体操作是：先用酸性盐酸胍处理阳性珠，洗脱掉结合的噬菌体和抗体；然后用溴化氰（CNBr）切割微珠内部的编码标签接头，释放出编码标签分子；最后，使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析释放出的三个标签的分子量。通过比对预先建立的构件分子量表（R1， R2， R3各自对应特定的分子量增量），可以唯一地确定组成该小分子的三个化学构件，从而“解码”出91个阳性小分子的完整化学结构。研究还开发了MATLAB脚本辅助解码过程。

步骤四：活性小分子的复合成与初步生物活性评价 为了验证筛选出的小分子是否具有功能，团队从91个解码结构中随机选择了19个，将其重新合成为可溶性的游离小分子（不含与微珠连接的接头）。使用MTT法在白血病Jurkat细胞系上测试这些化合物的细胞毒性。结果显示，其中4个化合物（命名为LWW29， LWW31， LWW32， LWW55）在40 μM浓度下对Jurkat细胞表现出明显的细胞毒性。这初步证明，通过库对库筛选发现的小分子能够进入细胞并影响细胞功能。

步骤五：靶蛋白的鉴定与结合验证 这是本研究最具特色的环节之一。为了找出与上述活性小分子（特别是LWW31）结合的蛋白质靶点，团队采用了反向噬菌体淘选（biopanning）和下拉（pull-down）实验相结合的策略。 1. 噬菌体淘选：针对每个感兴趣的小分子（如LWW31），将其重新合成并固定在大量（约2万个）微珠上。然后，用另一个商业化的T7噬菌体展示肝癌（HepG2）cDNA文库，对这些固定了小分子的微珠进行四轮“吸附-洗脱-扩增”的淘选。目的是富集并纯化出那些展示能与该小分子特异性结合的蛋白质片段的噬菌体克隆。 2. DNA测序与靶点鉴定：从最终富集的噬菌斑中挑取克隆，通过PCR扩增其携带的cDNA插入片段，并进行DNA测序。将测序结果输入BLAST数据库进行比对，即可鉴定出所展示的蛋白质结构域。对于LWW31，淘选结果指向了真核翻译起始因子5B（eukaryotic initiation factor 5B， eIF5B）的N端结构域（第248-351位氨基酸）。 3. 下拉实验验证：为了在更接近生理环境的条件下验证小分子与靶蛋白的结合，团队合成了带有生物素（biotin）标签的LWW31分子（LWW31-LKB）。用这种生物素化的小分子作为“鱼饵”，从Jurkat或HepG2细胞裂解液中“钓取”（pull-down）结合的蛋白质。随后的SDS-PAGE和Western blotting分析（使用抗eIF5B抗体）明确显示，LWW31-LKB能够从两种细胞裂解液中特异性地下拉eIF5B蛋白，而阴性对照（单独的接头-赖氨酸-生物素片段或结构类似的LWW29-LKB）则不能。这强有力地证实了库对库筛选和噬菌体淘选所发现的LWW31-eIF5B相互作用在细胞环境中是真实存在的。

步骤六：小分子功能的深入机制研究 在确认靶点后，研究进一步探索了LWW31发挥细胞毒性的分子机制。 1. 诱导细胞凋亡：通过流式细胞术分析碘化丙啶（PI）染色的细胞DNA含量，发现用LWW31处理的Jurkat细胞出现了明显的亚G1期峰（hypodiploid sub-G1 peak），这是细胞凋亡导致DNA碎片化的特征性标志，表明LWW31通过诱导细胞凋亡来杀伤癌细胞。 2. 抑制蛋白质翻译：鉴于其靶点eIF5B是关键的翻译起始因子，研究人员推测LWW31可能抑制蛋白质合成。他们进行了[35S]-甲硫氨酸掺入实验。将HepG2细胞在含LWW31和放射性[35S]-甲硫氨酸的培养基中培养，然后分析细胞总蛋白的放射性强度。结果显示，LWW31处理能以剂量依赖的方式显著降低新合成蛋白质中[35S]的掺入量，证明它确实抑制了细胞的全局蛋白质翻译。在兔网织红细胞裂解物体外翻译系统中，LWW31也抑制了荧光素酶的报告基因表达，进一步支持了这一结论。

三、 研究主要结果 1. 成功建立并验证了“库对库”高通量筛选平台：研究首次将OBOC小分子库与噬菌体展示cDNA蛋白质组库进行大规模直接互筛，一次性评估了约10^13种可能的分子相互作用，并成功识别出91个相互作用对。 2. 发现具有抗癌活性的小分子先导化合物：从解码的91个小分子中随机验证的19个里，有4个（LWW29， 31， 32， 55）显示出对癌细胞的细胞毒性，其中LWW31对肝癌细胞HepG2的抑制活性（IC50 ~30 μM）高于对正常肝细胞（IC50 ~50 μM），显示出一定的选择性。 3. 快速鉴定了活性小分子的作用靶点及结合域：通过反向噬菌体淘选，成功为多个小分子（包括LWW31）找到了其结合的蛋白质靶点。特别是，将LWW31的作用靶点精确锁定为eIF5B蛋白的N端一个特定结构域（aa 248-351），这比传统方法（如细胞裂解液下拉结合质谱鉴定）更为直接和快速。 4. 阐明了LWW31的作用机制：结合下拉实验、细胞凋亡分析和蛋白质合成抑制实验，完整地揭示了LWW31通过结合eIF5B的N端结构域，抑制细胞内蛋白质翻译，最终诱导癌细胞凋亡的分子通路。 5. 初步构建了小分子-蛋白质结构域相互作用数据库：研究将91个小分子与其通过噬菌体淘选鉴定出的潜在结合蛋白质信息配对，形成了一个有价值的数据资源（部分展示于论文的附表S5中），为后续的功能蛋白质组学研究和药物发现提供了丰富的起点。

四、 研究结论与价值 本研究成功开发并实践了一种革命性的“库对库”筛选策略。该策略的核心价值在于将“寻找活性化合物”和“发现其作用靶点”这两个通常分离的药物发现关键步骤融为一个高效、集成的过程。

科学价值： 1. 方法学创新：为大规模、无偏地绘制小分子-蛋白质相互作用图谱提供了强大的新工具。它特别擅长发现针对低丰度蛋白或未知功能结构域的小分子配体，克服了传统细胞裂解液筛选偏向高丰度蛋白的缺点。 2. 基础生物学发现：不仅发现了新的活性小分子，还揭示了一个前所未有的生物学现象：靶向eIF5B N端特定区域（过去被认为是非必需的）的小分子能够有效抑制翻译并诱导凋亡。这为研究eIF5B蛋白的结构与功能，以及开发靶向翻译起始过程的新型抗癌策略提供了新的视角和工具分子。

应用价值： 1. 加速药物发现进程：相较于传统方法需要数周甚至数月来鉴定一个靶点，此方法能在几天内为数十个配体确定候选靶点结构域，大大提高了从“苗头化合物”（hit）到“先导化合物”（lead）研究的效率。 2. 降低成本与技术门槛：整个流程主要依赖于组合化学合成、比色筛选、质谱解码和常规分子生物学技术，无需昂贵的机器人自动化系统或复杂的高端仪器，使得更多研究机构能够应用此策略。 3. 资源库建设：产生的小分子-蛋白质对数据库本身就是一个宝贵的资源，可用于开发特定生化途径的探针、亲和纯化试剂，或作为新药研发的起点。

五、 研究亮点 1. 范式转换：从“一（靶/探针）对多库”的传统思维，转变为“多（化合物）对多（蛋白）”的直接互筛，是筛选理念上的一次重要突破。 2. 巧妙的解码与验证闭环：将OBOC的化学编码解码、噬菌体展示靶点鉴定、以及生物化学/细胞生物学功能验证有机结合，形成了一个自洽、严谨的研究闭环，确保了发现结果的可靠性。 3. 兼具广度与深度：研究不仅展示了平台发现大量相互作用对的“广度”（91个结合对），还对其中的典型实例（LWW31）进行了从靶点鉴定到机制阐明的“深度”挖掘，体现了完整的研究链条。 4. 解决实际难题：直接鉴定小分子结合的蛋白质结构域，而非全长蛋白，这为后续基于结构的药物设计和机制研究提供了更精确的切入点。

这项研究展示了一种极具潜力的药物发现新范式。它不仅报告了一个具有抗癌潜力的新化合物LWW31及其新机制，更重要的是提供了一套能够系统性地加速“靶点-配体”配对发现的方法论体系，对化学生物学和创新药物研发领域具有重要的启发意义和实用价值。