单细胞分析揭示胰腺癌化疗重塑与CD276驱动的基底样化疗耐药
作者、机构与发表信息 本项研究由张尧、杜艳华、王佳欣、王丹书、李举东、张静、赵一舟、孙思深、孙洪祥、齐晶晶、鲍如娟、邵成浩、张敏敏、贺祥义、张玲、周春华、王栋、苏冰、邹多武、叶幼琼共同完成。作者团队主要来自上海交通大学医学院附属瑞金医院消化内科、上海免疫学研究所、上海交通大学医学院-耶鲁大学免疫代谢研究所、海军军医大学附属长征医院胰胆外科及病理科。该研究于2025年发表在学术期刊《Gastroenterology》上。
学术背景与研究目的 本研究属于肿瘤学与免疫学交叉领域，聚焦于胰腺导管腺癌（PDAC）的化疗耐药机制。胰腺导管腺癌是一种高度恶性、预后极差的肿瘤，多数患者在诊断时已处于晚期，无法手术，需依赖全身化疗。白蛋白结合型紫杉醇联合吉西他滨（AG方案）是标准一线治疗方案之一，但疗效有限，患者反应差异巨大。这种治疗反应的异质性被认为与肿瘤微环境（TME）密切相关，然而，化疗究竟如何动态重塑肿瘤细胞的可塑性及其与TME中免疫、基质细胞的相互作用，从而影响临床结局，此前尚不明确。
PDAC肿瘤细胞主要存在两种转录亚型：经典亚型和基底样亚型。经典亚型分化较好，对化疗相对敏感，预后较好；而基底样亚型分化差，具有更强的侵袭性和化疗抵抗性。单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术已揭示同一肿瘤内可同时存在这两种亚型，显示了瘤内异质性。肿瘤微环境由恶性细胞、免疫细胞（如T细胞、巨噬细胞）和基质细胞等组成，是一个高度复杂的生态系统。尽管已知TME在PDAC进展和治疗抵抗中起关键作用，但化疗期间驱动肿瘤细胞亚型转换及免疫微环境重塑的具体细胞与分子机制仍是空白。
因此，本研究旨在通过高分辨率的单细胞和空间多组学技术，描绘AG化疗前后PDAC肿瘤微环境的动态变化图谱，鉴定与化疗反应和抵抗相关的关键细胞状态、细胞间互作网络及核心调控分子，以期发现克服化疗耐药的新靶点。
详细研究流程 本研究是一项结合临床队列、高通量测序、空间组学验证及体内外功能实验的系统性探索。其工作流程可分为以下几个主要部分：
临床样本收集与处理：研究纳入了28名新诊断的不可切除晚期PDAC患者，所有患者均接受AG方案化疗。研究团队在化疗前及治疗9周后，通过超声内镜引导下细针穿刺/活检（EUS-FNA/B）配对收集了36份新鲜肿瘤样本（其中8对为匹配的化疗前后样本），并同期收集了24份配对的外周血单个核细胞（PBMC）样本。根据实体瘤疗效评价标准（RECIST v1.1），将患者分为应答者（部分缓解，PR）和无应答者（疾病稳定或进展，SD/PD）。肿瘤组织样本经过酶消化和机械分离制成单细胞悬液，PBMC通过Ficoll密度梯度离心法分离。
单细胞多组学测序与数据分析：
空间组学验证：为了在组织原位确认单细胞分析发现的空间关系，研究采用了高分辨率空间转录组技术（2微米分辨率的10x Visium HD）和多重免疫荧光染色。这用于验证例如基底样肿瘤细胞、SPP1+巨噬细胞和耗竭T细胞是否在空间上形成紧密的“耐药生态位”。
体内外功能验证实验：
主要研究结果 1. 化疗差异性地重塑PDAC肿瘤微环境：单细胞图谱显示，化疗后应答者和无应答者的TME呈现截然不同的重塑模式。在应答者中，化疗后恶性细胞和巨噬细胞比例显著下降，而经典树突状细胞比例增加。相反，在无应答者中，恶性细胞比例无显著下降，T/NK细胞比例减少，中性粒细胞比例增加。这表明化疗疗效与特定的免疫和肿瘤细胞组成变化相关。
恶性细胞状态转换与化疗疗效直接相关：研究发现，化疗前，应答者的肿瘤中富含对化疗敏感的Gpx2+经典亚型恶性细胞，而无应答者则富含耐药的SNCG+基底样亚型细胞。化疗后，应答者的恶性细胞主要向经典状态转换，而无应答者的恶性细胞则进一步向基底样状态富集。RNA速率分析证实，LMO7+过渡态细胞具有双向分化潜能，可转向经典或基底样状态。预后分析表明，基底样特征与不良预后相关，经典特征与较好预后相关。
揭示SPP1+巨噬细胞-基底样恶性细胞轴促进化疗耐药：巨噬细胞分析发现，SPP1+肿瘤相关巨噬细胞（TAM）具有促血管生成、促肿瘤特性，且与不良预后相关；而FOLR2+巨噬细胞具有抗原呈递和吞噬功能，与较好预后相关。在无应答者中，SPP1+ TAMs比例维持高位；而在应答者中，FOLR2+巨噬细胞增加，SPP1+ TAMs减少。配体-受体互作分析及空间验证显示，SPP1+ TAMs与SNCG+基底样恶性细胞存在密切的空间邻近和特异性互作（如SPP1-SDC1, VEGFA-AXL），这些互作激活了恶性细胞中的糖酵解、缺氧和上皮细胞增殖相关通路。而在应答者中，FOLR2+巨噬细胞则与Gpx2+经典恶性细胞互作，激活细胞因子和炎症反应通路。
CD8+ T细胞向耗竭状态累积与化疗抵抗相关：T细胞分析发现，化疗后无应答者的肿瘤中，耗竭T细胞（Tex）和组织驻留记忆T细胞（TRM，可向Tex分化）比例显著增加，细胞毒性评分下降，耗竭评分上升。轨迹分析显示，CD8+ T细胞存在向终末Tex分化的路径。TCR克隆分析表明，应答者化疗后出现了新的、具有细胞毒性的Temra克隆扩增，而无应答者缺乏这种新克隆的扩增。这提示成功的化疗可能通过释放新抗原诱导了有效的抗肿瘤T细胞反应。
鉴定由基底样恶性细胞、Tex和SPP1+ TAMs构成的“化疗耐药生态位”：通过整合所有细胞亚群并计算其与临床反应的相关性，研究发现Tex状态（包括TRM和Tex）和SPP1+ TAMs在无应答者治疗后富集，且与不良治疗反应相关。空间相关性分析和多重免疫荧光证实，SNCG+基底样恶性细胞、Tex和SPP1+ TAMs在空间上紧密相邻，形成了一个独特的细胞群落，即“化疗耐药生态位”。
发现CD276/B7-H3是该耐药生态位的核心调控因子：在筛选该生态位中的关键调控分子时，免疫检查点分子CD276（B7-H3）脱颖而出。其表达在无应答者的基底样和过渡态恶性细胞中显著富集，且表达模式与恶性细胞向基底样状态转换的轨迹一致。空间转录组和MIF验证了B7-H3蛋白在基底样恶性细胞中的特异性高表达。公共数据库分析也显示，CD276/B7-H3的高表达与基底样状态、高血管生成评分和高T细胞耗竭评分显著相关，且与患者不良预后相关。
靶向CD276/B7-H3可逆转化疗耐药：
研究结论与意义 本研究通过构建AG化疗前后PDAC的单细胞及空间动态图谱，系统揭示了化疗耐药的形成机制。研究得出结论：在化疗无应答者中，肿瘤细胞倾向于从经典状态向化疗耐药的基底样状态转换，并与SPP1+促血管生成型巨噬细胞和耗竭的CD8+ T细胞在空间上形成紧密的“化疗耐药生态位”。CD276/B7-H3被鉴定为该生态位的核心双重功能调控因子：一方面，它作为肿瘤细胞内在的转录调控因子，驱动其向基底样状态转换；另一方面，它作为免疫检查点分子，促进T细胞耗竭并增强巨噬细胞的促血管生成特性。
本研究的科学价值在于，首次在单细胞和空间分辨率上系统描绘了PDAC化疗过程中肿瘤细胞可塑性与免疫微环境协同演变的动态全景图，并明确了CD276/B7-H3在这一过程中的枢纽作用。其应用价值在于，为克服PDAC化疗耐药提供了新的潜在治疗策略：靶向CD276/B7-H3，可能同时逆转肿瘤细胞的耐药状态并解除免疫抑制，从而与化疗产生协同增效作用。这为正在进行的针对B7-H3的抗体药物偶联物（ADC）或CAR-T细胞等靶向疗法与化疗的联合应用提供了强有力的理论依据。
研究亮点 1. 研究设计与技术的系统性：研究整合了配对临床样本的单细胞转录组、TCR/BCR库测序、高分辨率空间转录组、多重免疫荧光以及体内外功能验证，构成了一个从临床现象到分子机制再到治疗验证的完整证据链。 2. 动态与空间视角：不同于静态分析，本研究聚焦于化疗“前后”配对样本，动态揭示了TME重塑过程；结合空间技术，直观证实了“化疗耐药生态位”的存在，将细胞类型变化与空间组织关联起来。 3. 发现关键双重功能靶点：不仅将CD276/B7-H3定位为免疫检查点，更创新性地揭示了其驱动肿瘤细胞状态转换（从经典到基底样）的肿瘤内在功能，阐明了其连接肿瘤内在耐药与免疫抑制微环境的桥梁作用。 4. 临床转化意义明确：研究结论直接指向了可操作的联合治疗策略（抗B7-H3疗法联合化疗），并已在临床前模型中验证了其有效性，为后续临床试验奠定了基础。
其他有价值内容 研究还揭示了其他有价值的发现，例如：无应答者中CD47-SIRPα“别吃我”信号在基底样细胞中富集，提示其可能通过抑制巨噬细胞吞噬作用促进耐药；应答者中新出现的T细胞克隆扩增现象，为化疗联合免疫治疗（如针对过渡态Tex的免疫检查点抑制剂）提供了依据；研究构建的全面细胞图谱和定义的细胞亚群（如不同的巨噬细胞、T细胞亚群）为PDAC生物学研究提供了宝贵的资源。