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本研究由华中科技大学同济医学院附属协和医院癌症中心的翟丹怡、黄晶、胡彦，以及该院放射肿瘤学研究所和血液学研究所的多位研究人员共同完成。通讯作者为杨坤宇教授和金红林教授。该研究发表于《International Journal of Radiation Oncology • Biology • Physics》2022年第114卷第3期，页码为502至515。
研究的学术背景聚焦于肿瘤转移这一癌症致死的主要原因。约57%的肺癌患者会发生远处转移，转移性肺癌患者的5年相对生存率仅为6%，而局限性肺癌患者为59%。放射治疗作为肿瘤治疗的主要手段之一，虽能诱导远隔效应抑制已建立的转移灶，但是否能在转移发生之前预防转移形成尚不清楚。转移是一个多步骤过程，其中循环肿瘤细胞在远处器官的定植与生长依赖于一种支持性的组织微环境，即转移前微环境。原发肿瘤释放的细胞外囊泡，包括微颗粒，对转移前微环境的形成具有重要调控作用。既往研究表明，缺氧或紫外线诱导的肿瘤细胞来源微颗粒可促进转移前微环境的形成和肿瘤定植，而放射诱导的肿瘤细胞来源微颗粒是否能重塑转移前微环境并抑制转移尚未被阐明。本研究旨在探究放射诱导的肿瘤细胞来源微颗粒在肺转移前微环境重塑及肿瘤细胞肺内定植中的作用及其机制。
研究的工作流程包括多个层次：首先在细胞与动物水平建立模型。所用细胞系为小鼠肺癌细胞LLC和小鼠黑色素瘤细胞B16-F10，并建立了稳定表达荧光素酶的LLC-luc和B16-luc细胞以及表达红色荧光蛋白的LLC-RFP细胞。放射诱导微颗粒的制备方法为：将肿瘤细胞以6 MV X射线单次20 Gy照射后继续培养72小时，收集培养基，经差速离心去除细胞和碎片后，以14000 g离心1小时沉淀获得微颗粒，重悬于无菌磷酸盐缓冲液中备用。动物实验采用6至8周龄雄性C57BL/6小鼠及裸鼠。自发肺转移模型建立方法为：将1×10^6个LLC-RFP细胞皮下接种于小鼠右侧胁腹，待肿瘤直径达5至8毫米时，连续3天每天8 Gy照射局部肿瘤，照射结束后3天手术切除原发肿瘤，切除后14天取肺进行苏木精-伊红染色并计数肺内肿瘤结节。实验性肺转移模型建立方法为：将来源于5×10^6个肿瘤细胞的放射诱导微颗粒或未照射肿瘤细胞来源微颗粒经尾静脉注射，隔天一次共3次，随后经尾静脉注射1×10^6个LLC-luc或B16-luc细胞，采用体内生物发光成像检测肿瘤负荷，并通过肺切片苏木精-伊红染色计数肿瘤结节。循环肿瘤细胞检测采用武汉YZY医学科技公司提供的分离检测技术，对皮下荷瘤小鼠照射后24小时的外周血进行单个循环肿瘤细胞和循环肿瘤细胞簇计数，并通过克隆形成实验评估循环肿瘤细胞的增殖能力。机制研究方面，通过流式细胞术分析肺内免疫细胞亚群的变化，采用胶原酶V和透明质酸酶消化肺组织制备单细胞悬液，以CD45、CD11b、Ly6G、Ly6C、F4/80、CD86和CD206等抗体标记并鉴定中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞及其表型。利用共聚焦显微镜观察巨噬细胞和中性粒细胞对PKH26标记的微颗粒的体外吞噬情况。使用EasySep小鼠中性粒细胞富集试剂盒和单核细胞富集试剂盒分选骨髓来源的中性粒细胞和单核细胞。趋化因子检测采用LEGENDplex小鼠促炎趋化因子面板，对肺组织匀浆和中性粒细胞培养上清中的趋化因子进行多重检测。单核细胞趋化实验采用Transwell系统，上室接种单核细胞，下室加入CCL3或CCL4或经微颗粒刺激的中性粒细胞，12小时后收集下室细胞进行流式分析。逆转录聚合酶链反应用于检测中性粒细胞中MPO、iNOS、NOX2以及巨噬细胞中NOS2、IFN-α、IL-12、TGF-β和Arg1等基因的表达变化。活性氧水平采用二氯二氢荧光素二乙酸酯荧光探针结合流式细胞术检测，过氧化氢水平采用Amplite荧光过氧化氢检测试剂盒测定。中性粒细胞和巨噬细胞的体内耗竭分别采用抗Ly6G抗体腹腔注射和氯膦酸盐脂质体尾静脉注射加鼻吸入的方法实现。所有体外实验均设置三重复，组间比较采用双侧Student t检验或单因素方差分析。
研究结果首先显示，局部照射皮下肿瘤后，外周血中单个循环肿瘤细胞和循环肿瘤细胞簇数量显著增加，并且从照射组小鼠分离的循环肿瘤细胞形成的克隆数更多，表明其增殖能力更强。然而在自发肺转移模型中，照射组小鼠肺内转移结节数显著少于未照射组，且两组原发肿瘤大小在切除前无差异，排除了转移来源减少的影响。在实验性肺转移模型中，预先经尾静脉注射放射诱导微颗粒的小鼠肺内肿瘤结节数显著减少，肿瘤负荷降低，生存期显著延长。与未照射肿瘤细胞来源微颗粒相比，放射诱导微颗粒抑制肺内肿瘤定植的效果更为显著。在T细胞缺陷的裸鼠中，放射诱导微颗粒仍能抑制肺内肿瘤定植并延长生存期，提示该效应不依赖T细胞。通过体内外吞噬实验发现，肺内F4/80阳性的巨噬细胞和Ly6G阳性的中性粒细胞是吞噬放射诱导微颗粒的主要细胞群，Ly6C阳性的单核细胞也有少量吞噬。注射微颗粒后，肺内中性粒细胞在1小时即显著增多并于12小时恢复基线，单核细胞在4小时增多并于24小时恢复，巨噬细胞自6小时开始增多并持续至24小时。中性粒细胞或巨噬细胞耗竭实验显示，抗Ly6G抗体或氯膦酸盐脂质体均能明显逆转放射诱导微颗粒对肺内肿瘤定植的抑制效应并缩短生存期，提示中性粒细胞和巨噬细胞在该过程中不可或缺。趋化因子检测显示，注射微颗粒后4小时肺内CXCL9、CCL3、CCL4和CXCL13显著上调，但体外中性粒细胞与微颗粒共孵育后仅CCL3和CCL4显著分泌增加。Transwell实验证实CCL3和CCL4均能趋化单核细胞，且微颗粒刺激的中性粒细胞对单核细胞的趋化能力显著增强，该趋化效应可被抗CCL3和抗CCL4中和抗体显著抑制。表型分析显示，放射诱导微颗粒上调中性粒细胞中MPO、iNOS和NOX2的表达，升高活性氧和过氧化氢水平，使中性粒细胞向抗肿瘤表型转化；同时上调巨噬细胞中NOS2、IFN-α和IL-12等M1标志物，下调TGF-β和Arg1等M2标志物，促进巨噬细胞向M1型极化。体外共培养实验证实，经微颗粒预处理的中性粒细胞和巨噬细胞对LLC-luc细胞的活力具有显著抑制作用，而未处理的细胞对肿瘤细胞活力影响甚微。
本研究的核心结论为：放射诱导的肿瘤细胞来源微颗粒通过重塑肺转移前免疫微环境抑制肿瘤细胞肺内定植，该过程依赖于中性粒细胞和巨噬细胞，但不依赖T细胞。机制上，放射诱导微颗粒被中性粒细胞和巨噬细胞吞噬后，激活中性粒细胞分泌CCL3和CCL4，招募单核细胞进入肺组织，单核细胞分化为巨噬细胞并在微颗粒作用下极化为M1抗肿瘤表型，同时中性粒细胞也被直接活化为抗肿瘤表型，共同抑制肿瘤细胞的定植与增殖。这一研究揭示了放射治疗在预防远处转移方面的全新系统性效应，为临床放射治疗在转移预防中的应用提供了理论依据，也为开发基于微颗粒的新型抗转移策略指出了潜在方向。
本研究的亮点在于：首次阐明了放射诱导肿瘤细胞来源微颗粒对转移前微环境的直接调控作用；发现了中性粒细胞—CCL3/CCL4—单核细胞—巨噬细胞这一固有免疫细胞间级联调控轴在肺转移前微环境重塑中的关键地位；并通过体内耗竭实验和体外共培养实验建立了明确的因果证据链。此外，该研究采用了自发转移模型和实验性转移模型相互印证，增强了结论的可靠性。研究中使用的放射诱导微颗粒制备方法、体内吞噬追踪以及趋化因子中和实验等组合策略，为后续研究细胞外囊泡与转移前微环境相互作用提供了可参考的技术路径。