近日，一项针对亨廷顿病（Huntington’s disease， HD）潜在治疗策略的重要研究成果在*PNAS*期刊上正式发表。该研究由复旦大学华山医院神经内科、医学神经生物学国家重点实验室、脑科学前沿科学中心的Lu Boxun团队、Fei Yiyan团队、Ding Yu团队以及合作者共同完成，于2022年3月1日在线发表，题为“Suppression of toxicity of the mutant huntingtin protein by its interacting compound, desonide”。本研究不仅为这一“不可成药”的致病蛋白找到了一个潜在的治疗性化合物——地奈德，更重要的是提出并验证了一套针对此类靶点的创新药物发现策略。

亨廷顿病是一种遗传性神经退行性疾病，其主要致病原因是突变型亨廷顿蛋白（mutant huntingtin， mHTT）的毒性。与野生型亨廷顿蛋白（wild-type htt， wtHTT）相比，mHTT含有一段过度延长的聚谷氨酰胺（polyglutamine， polyQ）链。长期以来，mHTT被认为是“不可成药”的靶点，原因在于：第一，其精确的致病分子机制尚不完全明确，缺乏可测量的生化活性读数；第二，蛋白表面缺乏经典的、可被小分子占据以调节其功能的“可成药口袋”。因此，传统的基于抑制靶点活性的药物筛选策略在此处难以应用。面对这一挑战，研究团队提出了一个大胆的假设：即使无法直接抑制mHTT的“活性”，那些能够直接与mHTT结合的小分子化合物，也可能通过改变其构象和/或稳定性，从而抑制其下游毒性功能。这类化合物在更宽泛的定义下，同样可以看作是mHTT的“抑制剂”。基于此，本研究旨在通过“靶点结合物筛选→表型验证→机制研究”的管线，寻找能够选择性结合mHTT并挽救HD相关表型的化合物，为HD治疗提供新的线索和工具。

研究流程系统而严谨，可分为四个主要阶段：初始筛选、表型验证与初步体内测试、机制深入探究以及治疗潜力评估。

第一阶段：mHTT选择性结合化合物的筛选。 研究团队首先建立了一套基于小分子微阵列（small-molecule microarray， SMM）的高通量筛选平台。他们将包含3375个小分子的化合物库（含795个已知抑制剂、1053个天然产物和1527个FDA批准药物）共价固定在玻片上。随后，将纯化的绿色荧光蛋白（GFP）标记的mHTT外显子1片段（HTT-exon1-Q72）和wtHTT外显子1片段（HTT-exon1-Q25）分别流过微阵列芯片。通过与芯片上化合物结合而产生的GFP荧光信号，可以识别出与目标蛋白相互作用的化合物。为了筛选出对mHTT具有等位基因选择性的结合物，他们以wtHTT片段作为反筛，最终在两轮独立筛选中，重复鉴定出21个与mHTT特异性结合的先导化合物。

第二阶段：表型验证与体内初步测试。 获得潜在结合物后，研究转向功能性验证。他们首先在一个经典的HD细胞模型——STHdhQ7/Q111小鼠纹状体细胞中，测试了这21个化合物对mHTT依赖的细胞毒性的影响。该细胞在血清饥饿等应激条件下会呈现mHTT依赖性凋亡。通过高内涵成像技术检测caspase-3活性，他们发现其中5个化合物能在微摩尔浓度范围内显著挽救细胞存活。为了排除化合物可能通过影响凋亡通路等非特异性机制起效，研究者在野生型纹状体细胞（STHdhQ7/Q7）中，用蛋白酶体抑制剂MG132诱导非mHTT依赖的细胞凋亡进行反筛。结果显示，化合物gossypol在此模型中也表现出挽救作用，提示其可能具有非特异性效应。而另外四个化合物——地奈德（desonide）、巴多昔芬（bazedoxifene）、氯雷他定（loratadine）和伊潘立酮（iloperidone）则未表现出挽救作用甚至轻微加剧毒性，表明它们对mHTT依赖的毒性抑制是特异的。 随后，这四种化合物在多个HD模型中进一步验证了其表型挽救能力：在亨廷顿病患者诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经元中，它们显著降低了由脑源性神经营养因子（BDNF）撤除诱导的凋亡；在两种HD果蝇模型中（分别表达mHTT外显子1片段或全长mHTT），口服这些化合物显著改善了果蝇随年龄增长出现的攀爬行为缺陷。这些结果一致表明，这四种mHTT结合化合物在多种疾病模型中均能抑制mHTT毒性。 接下来，研究者在HD基因敲入小鼠模型（HdhQ140/Q140）中进行了初步的体内行为学测试，以对这四种化合物进行优先级排序。由于伊潘立酮注射后严重抑制了小鼠的基础活动能力，可能掩盖其对HD的潜在益处，因此被排除。其余三种化合物通过脑室内（intracerebroventricular， ICV）注射给药。结果显示，地奈德在改善小鼠的旷场活动、抓力、直立次数、横梁行走和旋转棒表现等一系列HD相关运动行为缺陷方面效果最为显著和全面，且对野生型小鼠无影响。因此，研究团队选择地奈德作为重点研究对象进行后续深入机制探索。

第三阶段：作用机制深入探究。 研究者首先探究地奈德如何发挥保护作用。他们在多种细胞和动物模型中发现，地奈德处理能剂量依赖性地、等位基因选择性地降低mHTT的蛋白水平，而不影响wtHTT。这种降低不是通过抑制基因表达实现的，因为蛋白酶体抑制剂MG132或epoxomicin可以完全阻断地奈德降低mHTT的效果，而自噬抑制剂氯喹或NH4Cl则不能，表明地奈德通过增强mHTT的蛋白酶体降解途径来降低其水平。 那么，地奈德如何特异性促进mHTT的降解呢？关键线索来自对其结合位点的研究。实验发现，地奈德不能降低其他由扩张polyQ引起的疾病（如脊髓小脑性共济失调3型）的致病蛋白ataxin-3的水平，且单纯的长polyQ链（与GFP融合）也无法与地奈德结合，说明polyQ扩张本身不是地奈德作用的充分条件。通过对mHTT外显子1片段（包含N端17个氨基酸、polyQ链和脯氨酸富集域）进行结构域缺失和点突变分析，他们发现了一个关键位点：第6位的赖氨酸（K6）。当mHTT的K6突变为精氨酸（K6R）时，地奈德与之结合的能力完全丧失，而其他位点（如K9， K15， E12）的突变则无影响。等温滴定量热法（ITC）和微量热泳动（MST）实验进一步证实了地奈德与mHTT的结合是等位基因选择性和K6依赖性的。 基于K6的关键作用，研究者假设地奈德可能影响了mHTT的泛素化修饰。免疫共沉淀实验证实，地奈德处理显著增强了mHTT外显子1片段的多聚泛素化（poly-ubiquitination），而这种增强同样具有等位基因选择性和K6依赖性（K6R突变使其消失，K9R或K15R突变则无影响）。与此一致，在功能上，地奈德能挽救由mHTT（Q72）或其K9R、K15R等突变体表达引起的细胞毒性，但对K6R突变体引起的毒性无效。这些数据强有力地表明，地奈德通过与mHTT（依赖于扩张polyQ和K6位点）直接相互作用，改变了其局部构象或可及性，从而特异性增强了mHTT在K6位点的多聚泛素化，进而通过蛋白酶体途径加速其降解，最终降低mHTT的细胞毒性。

第四阶段：外周给药治疗潜力评估。 地奈德是一种FDA批准的用于治疗特应性皮炎的局部皮质类固醇药物，其安全性已有一定数据。为了评估其通过外周给药治疗HD的可行性，研究者进行了药代动力学初步实验，发现腹腔注射（intraperitoneal， IP）地奈德后，其在小鼠脑内浓度可达2-3 μM。随后，他们在不同月龄（10、12、15个月）的杂合子HD敲入小鼠（HdhQ7/Q140）中进行了为期4周的腹腔注射给药实验。结果表明，地奈德治疗能显著改善各年龄组HD小鼠的运动行为缺陷，降低纹状体中mHTT聚集体水平，并部分恢复DARPP-32（纹状体中型多棘神经元的标志物）和神经丝轻链（neurofilament light chain， NfL，神经损伤的生物标志物）的水平，且对野生型小鼠无不良影响。这证明了地奈德通过外周给药途径具有改善HD病理和症状的潜力。

本研究的主要结论在于：第一，成功发现FDA已批准药物地奈德是mHTT的等位基因选择性结合剂，能够通过增强mHTT的K6位点多聚泛素化来促进其蛋白酶体降解，从而在细胞和动物模型中有效抑制mHTT毒性，改善HD相关表型，展现了其作为HD治疗候选药物的潜力。第二，也是更具普适性意义的一点，本研究成功实践并验证了一套针对“不可成药”靶点的创新药物发现策略：即首先筛选与靶点直接结合的化合物，随后进行下游疾病相关表型的验证，并通过反筛排除非特异性效应，最终对先导化合物进行机制研究和体内功效评估。这套“靶点结合物筛选→表型验证→机制研究”的管线，为针对那些缺乏明确活性位点和生化读数的致病蛋白的药物开发提供了新的思路和范例。

本研究的亮点突出体现在以下几个方面：首先，策略创新性强：跳出了传统“抑制活性”的思维定式，提出了以“结合并改变毒性”为目标的新型药物发现范式，为解决神经退行性疾病等领域“不可成药”靶点的难题提供了切实可行的技术路线。其次，发现具有转化潜力：将已上市药物地奈德“老药新用”于HD治疗，由于其已知的安全性数据，可能加速其向临床转化的进程。第三，机制研究深入透彻：从表型到蛋白水平，再到降解途径、结合位点和具体的翻译后修饰（K6泛素化），研究层层递进，逻辑严密，完整阐明了地奈德的作用机制，尤其是发现了K6这一关键位点。第四，模型系统全面：研究综合运用了SMM筛选、细胞模型（小鼠细胞、患者iPSC神经元）、果蝇模型和小鼠模型等多种体系，从体外到体内，从分子到行为，证据链完整，说服力强。

此外，研究还排除了地奈德通过其已知靶点糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor， GR）起效的可能性，进一步支持了其作用是通过直接结合mHTT介导的。这项研究不仅在亨廷顿病的治疗探索上取得了重要进展，更重要的是其提出的药物发现策略具有广泛的方法学意义，有望应用于其他由“不可成药”蛋白引起的疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病等，为神经退行性疾病的药物研发开辟了新的路径。