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单细胞水平蛋白质组学分析平台的开发及其在循环肿瘤细胞研究中的应用

作者及发表信息
本研究由多伦多大学Leslie Dan药学院的Yuan Ma、Kangfu Chen、Fan Xia等共同完成，通讯作者为Shana O. Kelley教授。论文于2021年11月23日发表在*ACS Nano*期刊（卷15，页19202-19210），标题为《Phage-Based Profiling of Rare Single Cells Using Nanoparticle-Directed Capture》。

学术背景
研究领域为单细胞蛋白质组学（single-cell proteomics），聚焦于稀有细胞（如循环肿瘤细胞，CTC）的表面蛋白表达分析。当前，单细胞转录组和基因组技术已较成熟，但蛋白质组学分析仍面临挑战，尤其是CTC这类稀有细胞（每毫升血液中仅含1-10个）的捕获与多参数检测。传统方法难以同时实现高效捕获、活细胞培养和多靶标蛋白定量。本研究旨在开发一种集成微流控芯片（single-cell proteomics chip, SCP芯片），结合噬菌体展示抗体（phage-displayed antibodies）和下一代测序（NGS），实现对CTC表面蛋白的动态监测。

科学问题包括：(1) 如何高效捕获稀有细胞并维持其活性；(2) 如何实现单细胞水平的多蛋白并行定量；(3) 探究CTC在转移过程中关键受体（如Frizzled2, FZD2）的表达变化与微环境的关系。

研究流程与方法
1. SCP芯片设计与制备
- 结构：芯片为三层设计，上层为含32个捕获通道的PDMS微流控层，中层为钴基磁性导板（Metglas 2714A），下层为钕磁铁。捕获通道内设4个象限形陷阱结构（半径8 μm），通过磁性纳米颗粒（anti-EpCAM或anti-Myc修饰）引导细胞至陷阱。
- 创新点：通过COMSOL模拟优化磁场分布，计算细胞所受磁力（公式：( Fm = nV{bead} \Delta \chi_{bead} (B \nabla)B / \mu_0 )）与流体阻力平衡，确保90%捕获效率（图1d）。

1. 细胞捕获与培养验证

   • 模型细胞：使用MCF-7（高EpCAM表达）与Hela（低EpCAM）混合样本（比例1:1至1:1000），以及H460 NSCLC细胞（带Myc标签）。
     
   • 结果：在血液背景下，经梯度离心后捕获效率恢复至90%，且细胞可在纤维连接蛋白包被的芯片中存活4天（图2b, S2d）。
     

2. 噬菌体抗体条形码技术

   • 原理：利用M13噬菌体展示的抗体片段（Fab），其互补决定区（CDR-H3）作为条形码，通过NGS定量结合抗原的数量（图3a）。
     
   • 校准实验：将不同浓度的EGFR靶向Fab-phage加入H460细胞，验证结合线性（图3d）。采用物理切割法（6 pL体积）减少非特异性结合，信噪比提升3倍（图4a, S4a）。
     

3. 单细胞蛋白表达分析

   • 靶标：检测6种蛋白（EGFR01/02、FZD1/2/7、荧光素酶对照）。
     
   • 发现：单细胞水平显示FZD2表达显著低于群体细胞（p=0.03），提示微环境影响（图4c-d）。通过qPCR验证FZD2 mRNA水平差异（图4d）。
     

4. CTC动态研究

   • 小鼠模型：将H460-Myc-GPI细胞移植至免疫缺陷鼠，3周后采集血液分离CTC。
     
   • 关键结果：捕获的CTC在24小时后FZD2表达下调（p=0.0003），可能与转移中的部分上皮-间质转化（partial EMT）相关（图5c-d）。
     

主要结果与逻辑关联
- 捕获效率：SCP芯片的高效性为后续单细胞分析奠定基础（图2b）。
- 蛋白动态：FZD2在CTC附着后下调，提示其在转移早期的作用（图5d）。
- 技术验证：噬菌体抗体与NGS的结合实现了多靶标并行定量（图6a），且与qPCR结果一致（图6b）。

结论与价值
1. 科学价值：
- 首次将微流控捕获、活细胞培养与噬菌体抗体-NGS整合，为单细胞蛋白质组学提供新工具。
- 揭示FZD2在CTC转移中的动态表达，丰富了肿瘤微环境调控的理论。

1. 应用价值：
   
   • SCP芯片可扩展至其他稀有细胞（如干细胞、免疫细胞）分析。
     
   • 噬菌体抗体库的复用性支持大规模癌症标志物筛查。
     

研究亮点
1. 技术创新：
- 磁性纳米颗粒与微流控陷阱的协同设计，突破稀有细胞捕获瓶颈。
- 物理切割法最小化背景噪声，提升单细胞数据可靠性。

1. 生物学发现：
   
   • FZD2作为CTC转移的潜在调控因子，为靶向治疗提供新思路。
     
   • 3D球体培养与芯片数据的对比，凸显微环境对蛋白表达的影响（图S5a）。
     

其他亮点
- 作者开源了芯片设计（Supporting Information），便于技术推广。
- 研究得到加拿大卫生研究院（CIHR）和自然科学与工程研究委员会（NSERC）的资助，体现了其学术认可度。

此研究通过跨学科方法解决了单细胞蛋白质分析的难题，并为癌症转移机制研究提供了新视角。