超声响应型工程菌时空调控干扰素-γ表达用于肿瘤免疫治疗的研究报告
一、研究团队与发表信息
本研究由Yuhao Chen（1,2,3,5）、Meng Du（1,2,5）、Zhen Yuan（3）、Zhiyi Chen（1,2）和Fei Yan（4）共同完成，作者单位包括南华大学衡阳医学院第一附属医院医学影像中心、澳门大学健康科学学院认知与脑科学中心、中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所等。研究成果于2022年发表于Nature Communications，论文标题为《Spatiotemporal control of engineered bacteria to express interferon-γ by focused ultrasound for tumor immunotherapy》，DOI: 10.1038/s41467-022-31932-x。
二、学术背景
科学领域：本研究属于合成生物学与肿瘤免疫治疗的交叉领域，结合了细菌疗法、基因工程和超声物理技术。
研究动机：细菌疗法因其天然靶向肿瘤缺氧核心区的能力备受关注，但传统方法难以实现治疗基因的时空可控表达。化学诱导剂缺乏组织特异性，光控技术穿透深度不足，而超声因其无创性、深层组织穿透性和精准温控特性成为理想选择。
背景知识：
1. 细菌疗法：工程化细菌（如大肠杆菌MG1655）可靶向肿瘤缺氧区域，并携带治疗基因（如干扰素-γ，IFN-γ）增强抗肿瘤效果。
2. 温度敏感基因回路：λ噬菌体启动子（Pl/Pr）在低温（28–30°C）下被ci857阻遏蛋白抑制，高温（42–45°C）下解除抑制，驱动外源基因表达。
3. IFN-γ的免疫调节作用：促进肿瘤细胞凋亡、巨噬细胞M1极化（促炎表型）和T细胞激活。
研究目标：开发一种超声响应型细菌（Ultrasound-Responsive Bacterium, URB），通过聚焦超声（Focused Ultrasound, FUS）远程控制IFN-γ的时空表达，提升肿瘤免疫治疗效果。
三、研究流程与实验设计
1. 工程菌构建与验证
- 质粒设计：将IFN-γ或mCherry报告基因插入pbv220质粒的Pl/Pr启动子下游，并转化至大肠杆菌MG1655。
- 温度诱导验证：37°C下基因表达被抑制，45°C加热30分钟后可检测到mCherry荧光或IFN-γ蛋白（Western blot验证）。
- 超声参数优化：通过调整声压（4.93 MPa）和辐照周期（3秒开/5秒关），实现细菌溶液恒温45°C，且不影响细菌活性（菌落计数验证）。
2. 体外抗肿瘤效果验证
- IFN-γ分泌检测：超声辐照20–80分钟，ELISA显示IFN-γ分泌量随时间增加。
- 肿瘤细胞杀伤实验：CCK-8检测显示，150 pg/mL IFN-γ使4T1乳腺癌细胞存活率降至33.13%，Calcein-AM/PI染色证实细胞凋亡。
- 巨噬细胞极化：流式细胞术显示，IFN-γ处理的RAW 264.7巨噬细胞CD80+（M1表型）比例升至41.8%，CD206+（M2表型）下降，NO分泌增加。
3. 体内靶向性与治疗效果
- 肿瘤靶向性：DIR标记的URB静脉注射后48小时，肿瘤荧光强度比死亡细菌组高5倍，且主要分布于缺氧区域（HIF-1α免疫荧光共定位）。
- 单侧肿瘤模型：URB+FUS组肿瘤体积抑制率最高（<250 mm³ vs 对照组>1000 mm³），生存期延长至60天（对照组42天）。TUNEL和Ki67染色显示细胞凋亡增加、增殖减少。
- 免疫微环境调控：流式分析显示URB+FUS组肿瘤内CD4+/CD8+ T细胞和M1巨噬细胞显著增加，Treg细胞（Foxp3+CD4+）减少，IFN-γ、TNF-α等促炎因子水平升高。
4. 远端肿瘤与转移抑制
- 双侧肿瘤模型：仅照射原发肿瘤后，远端肿瘤生长亦受抑制，肺转移灶减少80%。
- 脾脏免疫记忆：中央记忆T细胞（CD44+CD62L+）比例增加，血清IFN-γ水平持续升高。
5. 安全性评估
- 组织病理学：H&E染色显示主要器官无损伤，血常规和生化指标正常。
- 细菌清除：URB在正常器官（心、肝、脾等）中7天后被清除，但在肿瘤中持续定植至21天。
四、主要结果与逻辑链条
1. 基因回路有效性：温度/超声成功激活IFN-γ表达，体外实验验证其促凋亡和免疫激活功能。
2. 靶向递送：活菌选择性定植肿瘤缺氧区，为局部治疗提供基础。
3. 协同抗肿瘤：超声诱导的IFN-γ分泌激活全身免疫（T细胞、巨噬细胞），抑制原发灶、远端肿瘤及转移。
4. 安全性：非致病菌株和可控超声参数确保治疗安全性。
五、结论与价值
科学价值：
- 首次将超声热效应与合成生物学结合，实现深部肿瘤基因表达的时空精准调控。
- 揭示了细菌-超声联合疗法通过免疫记忆抑制远端肿瘤的机制。
应用价值：
- 为实体瘤（如乳腺癌、肝癌）提供了一种无创、可控的免疫治疗新策略。
- 可扩展至其他细胞因子（如TNF-α）或CAR-T细胞的远程调控。
六、研究亮点
1. 创新方法：开发了首个超声响应型工程菌（URB），结合了细菌靶向性和超声无创优势。
2. 多模型验证：涵盖皮下、原位和转移瘤模型，系统性证明疗效。
3. 免疫机制深度解析：从细胞极化到全身免疫记忆，完整阐明IFN-γ的作用通路。
其他价值：
- 为深部肿瘤（如胰腺癌、卵巢癌）的靶向治疗提供了新思路。
- 研究参数（如超声辐照周期）可为后续临床转化提供参考。