本文介绍了一项由Elian Dupré, Clément Danis等人领导的研究，该研究发表于《ACS Chemical Neuroscience》期刊，2019年8月5日正式在线发表。研究工作主要由法国里尔大学结构功能糖生物学联合研究所（UMR 8576 - UGSF）、让-皮埃尔·奥伯特神经科学与癌症研究中心（UMR-S 1172 - JPARC）以及Hybrigenics Services公司合作完成。这项研究属于神经科学和化学生物学的交叉领域，其核心目标是开发和应用新型的单域抗体片段（也称为纳米抗体或VHHs），以检测和研究与阿尔茨海默病等tau蛋白病相关的神经元tau蛋白，特别是在细胞和小鼠模型中进行研究。
本研究的学术背景源于对tau蛋白在神经退行性疾病中作用的深入理解。Tau蛋白是一种主要位于轴突的神经元蛋白，负责微管组装和稳定性的调节。然而，在阿尔茨海默病（AD）等tau蛋白病中，tau蛋白发生异常聚集，形成细胞内神经原纤维缠结（NFTs），其病理机制，特别是tau聚集和病理在脑区间传播的分子机制尚未完全阐明。因此，开发能够精确探测tau蛋白在生理和病理状态下行为的新型工具至关重要。传统的免疫球蛋白G（IgG）抗体虽然有效，但存在生产成本高、难以穿过血脑屏障等问题。单域抗体片段（VHHs）作为从骆驼科动物中发现的一种仅含重链可变区的小型抗体片段（约13 kDa），具有易于生产、易于穿越生物屏障（如血脑屏障）并可被改造用于细胞内表达等优势，为研究tau蛋白病理生理学提供了极具潜力的新工具。本研究的主要目的就是生成、表征并优化一组针对tau蛋白的新型VHHs，并验证其在细胞培养模型和转基因小鼠模型中作为检测和功能研究工具的可行性。
本研究的工作流程可以概括为几个连续的阶段：VHHs的筛选与鉴定、亲和力表征、细胞内功能验证、表位精确映射、VHHs的亲和力优化，以及最终的生物应用测试。
第一，VHHs的筛选与鉴定。 研究团队使用一个合成的人源化骆驼单域抗体噬菌体展示文库，针对生物素化的全长重组tau蛋白（最长的2N4R异构体）进行筛选。经过三轮筛选和交叉验证（非吸附噬菌体ELISA），最终获得了一个由六个不同VHHs组成的家族。这些VHHs共享完全相同的CDR3环序列，但CDR1和CDR2环序列不同。为了确定这些VHHs的结合表位，研究采用了核磁共振波谱（NMR）技术。具体方法是，获取15N标记的tau蛋白（15N-tau）的一维1H, 15N异核单量子相干谱（HSQC），然后加入未标记的VHH（以F8-2为代表），通过比较结合前后谱图中特定氨基酸残基共振峰的化学位移变化或强度衰减，来映射tau蛋白上与VHH相互作用的区域。结果显示，当VHH F8-2存在时，tau蛋白C端结构域（约370-386位氨基酸区域）的共振峰强度显著降低，表明这是F8-2的主要结合区域。其他五个共享相同CDR3环的VHHs也显示出相同的表位结合模式，证实了这一家族VHHs识别的是tau蛋白C端结构域内的一个共同区域。
第二，亲和力表征。 为了定量评估VHHs与tau蛋白结合的强度，研究使用了表面等离子体共振（SPR）光谱技术。首先将生物素化的tau蛋白固定在一个链霉亲和素功能化的传感器芯片上。然后，分别将六个纯化的VHHs作为分析物流过芯片表面，通过监测结合和解离过程中的共振信号变化，计算出结合动力学参数：结合速率常数（kon）、解离速率常数（koff）以及平衡解离常数（Kd）。尽管这六个VHHs共享相同的CDR3环，但测得的Kd值范围却在0.7 μM到4.5 μM之间。这个结果表明，除了CDR3环，CDR1和CDR2环在调控结合动力学和最终亲和力方面也起着重要作用，揭示了VHH结合特性的微调机制。
第三，细胞内功能验证（作为胞内抗体Intrabody）。 为了验证VHH在活细胞内仍能保持其结合能力，研究选择VHH F8-2作为代表，将其与m-Cherry红色荧光蛋白融合（VHH F8-2-m-Cherry），并在小鼠神经母细胞瘤细胞系（N2a）中进行表达。同时，构建了一个定位在质膜上的GFP-tau融合蛋白（质膜-GFP-tau），以便于观察tau蛋白的分布。当单独表达VHH F8-2-m-Cherry时，红色荧光主要定位于细胞核。然而，当与质膜-GFP-tau共表达时，VHH F8-2-m-Cherry的红色荧光分布发生了显著改变，从核内定位转变为与质膜-GFP-tau的绿色荧光高度共定位，几乎不再出现在细胞核中。这一分布变化清晰地表明，VHH F8-2在细胞内环境（细胞质）中能够正确折叠并保持活性，能够特异性地结合其靶标tau蛋白，并被tau“招募”至质膜位置，从而证明了其作为有效“胞内抗体”的潜力。
第四，表位精确映射。 NMR实验识别出的结合区域较大（约17个氨基酸），为了精确定义VHH F8-2识别的最小表位序列，研究利用了酵母双杂交系统。他们将VHH F8-2作为“诱饵”（Bait），与一个包含各种tau蛋白片段的“猎物”（Prey）文库进行筛选。通过对84个阳性克隆中tau片段序列的分析，找到了所有片段共有的最小氨基酸序列：373THKL TF378。这个六肽完全包含在NMR识别出的370-386区域内，从而精确地定义了VHH F8-2的核心结合表位。这个结果也说明了NMR在快速鉴定大范围结合区域上的优势，而酵母双杂交则在精确界定最小相互作用序列上更为有效。
第五，VHHs的亲和力优化。 鉴于初始VHHs家族的亲和力在微摩尔范围，且不同成员间存在差异，研究团队旨在进一步提高其结合强度。他们采用了一种结合有限随机突变和酵母双杂交筛选的策略。首先，对VHH F8-2的整个编码序列进行随机突变，构建一个突变体文库，并在酵母中表达为“猎物”（与Gal4激活域融合）。使用包含tau蛋白C端部分（310-383位氨基酸）的片段作为“诱饵”（与LexA DNA结合域融合）。通过在缺乏组氨酸的筛选培养基中加入不同浓度的竞争性抑制剂3-AT来施加选择压力，筛选那些与tau蛋白相互作用更强（表现为在更高3-AT浓度下仍能生长）的VHH突变体。经过筛选和验证，获得了三个优化的VHH突变体：F8-2R111C（在CDR3环上发生单个氨基酸突变R111C）、F8-2S54L和F8-2S54L+T128A（后两者在框架区发生突变）。NMR证实这些优化突变体仍识别相同的tau表位。随后的SPR分析显示，这些突变体的亲和力得到了显著提升：F8-2R111C的Kd值从野生型的1.332 μM提高到了211 nM（约6倍），F8-2S54L和双突变体也达到了约500 nM的水平。值得注意的是，框架区的突变（如S54L）也能有效提升亲和力，再次印证了CDR1和CDR2环及其周围环境的重要性。此外，虽然双突变体F8-2S54L+T128A在体外SPR测试中亲和力与F8-2S54L相似，但在酵母细胞内筛选条件下表现更优，提示T128A突变可能提高了VHH在细胞环境中的稳定性。
第六，生物应用测试。 最后，研究评估了优化后的VHHs在传统生物学检测中的应用潜力。他们将亲和力最高的F8-2R111C及其衍生的“微型抗体”（Minibody，即两个VHH通过小鼠IgG2a的Fc片段连接形成的二聚体）用于蛋白质印迹（Western Blot）和免疫组织化学（IHC）分析。在Western Blot中，这些VHHs能够特异性检测重组tau蛋白以及转基因小鼠（THY-Tau30模型）脑组织裂解液中的tau，但检测人AD脑组织中的不溶性tau时灵敏度有限（在此实验条件下，甚至对照的C端抗体信号也很弱）。在免疫组织化学应用中，F8-2R111C微型抗体成功地对10个月大的THY-Tau30转基因小鼠海马CA1区脑切片中的tau蛋白进行了特异性标记，其信号模式与使用传统的抗tau C端多克隆抗体得到的结果高度重叠。而在tau敲除（KO-Tau）小鼠的脑切片中则没有检测到信号，证明了其检测的特异性。这验证了F8-2衍生的VHHs在复杂生物组织样本中检测tau病理的能力，效果堪比完整的IgG抗体。
本研究的主要结论是，成功生成并表征了一个针对tau蛋白C端结构域的新型单域抗体片段（VHHs）家族。通过噬菌体展示筛选、NMR表位作图、SPR亲和力分析、细胞内功能验证、酵母双杂交表位精确定位以及定向进化优化等一系列技术，不仅获得了能够特异识别tau特定表位（373THKL TF378）的工具，还显著提升了其结合亲和力。这些VHHs具有双重应用价值：首先，作为研究工具，它们可用于在体外、细胞内（作为胞内抗体）乃至整体动物水平上探测tau蛋白，帮助解密tau在生理和病理条件下的功能、定位及传播机制；其次，作为一种治疗策略的潜在候选，VHHs由于其小尺寸、易于工程化改造、潜在的跨越血脑屏障能力以及缺乏IgG的效应器功能（可能减少炎症副作用）等特点，为未来基于tau的免疫治疗（如被动免疫）提供了新的、更安全的可能性。
本研究的亮点在于：1. 方法学的系统性与创新性：研究整合了从抗体发现（噬菌体展示）、结构生物学表征（NMR）、生物物理学分析（SPR）、细胞生物学验证到体内应用评估的完整流程，展现了强大的跨学科技术整合能力。利用酵母双杂交进行VHH表位精确定位和亲和力成熟，是一种巧妙且高效的方法。2. 对VHH作用机制的深入洞察：研究不仅获得了工具，还深入探究了其特性。例如，发现共享相同CDR3环的VHH家族成员间存在显著的亲和力差异，强调了CDR1/CDR2环在结合中的贡献；同时，框架区的突变也能影响亲和力及胞内稳定性，为理性设计VHH提供了重要信息。3. 从体外到体内的完整验证链：研究证实了VHH F8-2不仅能在体外结合tau，还能在活细胞内作为功能性胞内抗体工作，并最终成功应用于转基因小鼠脑组织的tau病理检测，完成了从分子、细胞到组织水平的完整功能验证，极大地增强了其作为研究工具的可信度和应用前景。这项研究为tau蛋白病领域提供了一套强有力的新型分子工具，并为基于纳米抗体的神经退行性疾病研究和治疗开发开辟了新途径。