学术研究报告：基于流式细胞术的人类NK细胞活性评估细胞毒性实验方法

作者及发表信息
本研究由Fadi Kandarian、Gemalene M Sunga、Diana Arango-Saenz和Maura Rossetti共同完成，作者团队来自美国加州大学洛杉矶分校（UCLA）免疫遗传学中心。研究论文于2017年8月发表在《Journal of Visualized Experiments》（JoVE）第126期，文章编号e56191，DOI为10.3791/56191。

学术背景
自然杀伤细胞（Natural Killer cells, NK细胞）是先天免疫系统的关键效应淋巴细胞，负责清除肿瘤细胞和病毒感染的异常细胞。约30种单基因缺陷或其他病理状态可导致NK细胞功能或经典缺陷，表现为细胞毒性活性降低或缺失。传统评估NK细胞毒性的“金标准”是铬释放实验（Chromium Release Assay, CRA），但其依赖放射性同位素（⁵¹Cr），存在成本高、操作复杂及放射性危害等问题。因此，本研究旨在开发一种基于流式细胞术的非放射性替代方法，用于定量评估NK细胞毒性活性。该方法具有临床诊断和基础研究的双重应用潜力，并可结合流式细胞术的多参数分析能力，进一步探究NK细胞的表型与功能。

实验流程
1. 试剂制备
- 配制0.2% Tween-20工作液、IL-2（210 IU/mL）及CFSE（羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯，Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester）荧光染料（终浓度0.5 μM）。CFSE用于标记靶细胞（K562细胞系），通过其荧光信号区分效应细胞（NK细胞）与靶细胞。

1. 效应细胞分离

   • 外周血单个核细胞（PBMCs）：从4 mL肝素化全血中通过密度梯度离心法分离PBMCs，调整浓度至5×10⁶ cells/mL，并通过流式细胞术检测CD56+ NK细胞含量（健康人占比约5-15%）。
     
   • 纯化NK细胞（可选）：使用阴性富集法从PBMCs中分离NK细胞，纯度需≥80%，浓度调整为5×10⁵ cells/mL。
     

2. 靶细胞（K562）处理

   • K562细胞（人红白血病细胞系）因其低表达HLA I类分子和高表达NK细胞激活配体，对NK细胞毒性高度敏感。细胞需在37°C培养至对数生长期（活力≥85%），CFSE标记后避光孵育10分钟，淬灭反应后调整浓度至1×10⁵ cells/mL。
     

3. 共培养与毒性检测

   • 在96孔板中设置不同效应细胞（E）与靶细胞（T）比例（如50:1至6.25:1），并设立对照组（仅靶细胞、仅效应细胞、Tween-20诱导靶细胞死亡）。加入IL-2（27 IU/mL）作为阳性对照激活NK细胞。共培养4小时后，加入核酸染料（如膜渗透性死细胞染料）标记死亡靶细胞。
     

4. 流式细胞术分析

   • 通过CFSE（FITC通道）和死细胞染料（APC通道）双参数检测，计算CFSE+靶细胞中死细胞染料的阳性比例，即为NK细胞毒性活性。需采集至少1000个靶细胞事件以确保统计意义。
     

主要结果
1. 方法验证
- 对照组数据证实：靶细胞自发死亡率<15%（阴性对照），Tween-20诱导的靶细胞死亡率>85%（阳性对照），效应细胞无CFSE信号（特异性验证）。
- 健康供体的NK细胞毒性随E:T比例降低而递减（图4），而NK细胞功能缺陷患者的毒性活性显著降低。

1. 与传统方法的对比优势
   
   • 相较于CRA，本方法避免了放射性风险，成本更低，且可通过多参数流式分析同步检测NK细胞表型（如CD56表达）。
     
   • 使用PBMCs直接检测（无需纯化NK细胞）适用于临床小样本（如患者血液），提高了实用性。
     

结论与价值
本研究建立的流式细胞术方法为NK细胞毒性评估提供了高效、安全的标准化方案，具有以下价值：
- 临床应用：适用于NK细胞功能缺陷（如原发性免疫缺陷、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症）的诊断，以及造血干细胞移植后免疫重建监测。
- 科研扩展性：可通过替换靶细胞（如HL-60、Daudi）或调整荧光染料适配不同研究需求，支持NK细胞生物学或新型免疫疗法的开发。

研究亮点
1. 方法学创新：首次将CFSE标记与流式死细胞检测结合，简化了NK细胞毒性定量流程。
2. 临床适配性：直接使用PBMCs降低了样本需求，尤其适合儿科或免疫缺陷患者的小体积血液样本。
3. 多参数潜力：未来可整合更多荧光标记，同步分析NK细胞活化标志物（如CD107a）或细胞因子分泌。

其他注意事项
- 实验需严格控制靶细胞状态（避免冷藏，离心速度≤140×g）和孵育时间（≤4小时），以降低背景噪声。
- 健康个体的NK细胞活性受年龄、性别等因素影响，需设立匹配对照。

本研究通过视频（https://www.jove.com/video/56191/）直观展示实验操作，进一步提升了方法的重现性。