基于氨基酸衍生物的肽掺杂金属有机框架：一种通用封装与靶向递送平台
研究团队与发表信息
本项研究由以Benson Peter Mugaka、张升（共同一作）、李瑞琪、马宇、王博、洪进、胡懿侯（通讯作者）、丁亚（通讯作者）和夏兴华为代表的研究团队完成。研究发表于ACS（美国化学会）旗下期刊《ACS Applied Materials & Interfaces》，发表日期为2021年3月1日，卷期为第13卷，页码11195-11204。
学术背景
本研究属于生物医学纳米材料与药物递送领域，具体聚焦于生物金属有机框架（bio-MOFs）的设计、合成与应用。金属有机框架（Metal-Organic Frameworks, MOFs）是由金属离子或团簇与有机配体通过配位键连接形成的多孔晶体材料，因其组成多样、结构可调和良好的生物降解性，在药物递送领域展现出巨大潜力。特别是由生物分子（如氨基酸、肽、蛋白质等）构建的bio-MOFs，因其良好的生物相容性和低毒性，被视为更具前景的生物医用材料。
然而，现有bio-MOFs在面向实际生物医学应用时仍面临关键挑战：首先，赋予MOFs生物靶向性的策略通常操作繁琐、修饰效率低；其次，目前仍缺乏一种能通用性地封装不同类型治疗分子（如疏水化疗药、亲水蛋白质、带不同电荷的无机纳米颗粒等）的单一MOF平台，这限制了其在需要联合治疗的复杂疾病（如肿瘤）中的应用。因此，开发一种制备简便、能通用负载并具备精准靶向能力的bio-MOF体系具有重要的科学意义和应用价值。
本研究的核心目标是：开发一种简单的一锅法（one-pot）制备策略，构建一种肽掺杂的bio-MOF，该框架需具备以下能力：(1) 能够负载理化性质迥异的多种“货物”；(2) 在制备过程中即可便捷地引入靶向肽，实现主动靶向功能；(3) 在体内循环中保持稳定，并在肿瘤微环境的特定刺激（如低pH）下触发药物释放，从而实现精准治疗并降低系统毒性。
详细工作流程
研究整体上遵循了“材料设计合成→理化性质表征→体外功能验证→体内疗效评估”的系统性路径。
1. 材料的设计、合成与表征 研究对象与样本制备：研究以9-芴甲氧羰基修饰的组氨酸（Fmoc-His）作为主要有机配体，与锌离子（Zn²⁺）配位，构建了一种新型的Zn²⁺-Fmoc-His框架，命名为ZFh。通过简单的共混方式，将靶向肽Fmoc-His-Asp-Gly-Arg（Fmoc-HDGR）在合成过程中掺杂进入ZFh框架，得到靶向材料，记为ZFh-DGR。通过调整Fmoc-His与Fmoc-HDGR的投料摩尔比（如10%、20%），可以调控肽的掺杂密度。同时，研究考察了其他几种组氨酸/丙氨酸衍生物（His, Boc-His, Fmoc-Ala）与Zn²⁺配位的能力，以验证Fmoc-His构建框架的独特性。 实验方法与数据处理：采用一锅法在室温水溶液中合成ZFh和ZFh-DGR。通过透射电子显微镜（TEM）观察材料的形貌和尺寸。通过动态光散射（DLS）测量其流体力学直径和Zeta电位。利用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析材料的化学键和官能团，确认配位成功和肽的掺杂。通过X射线衍射（XRD）分析材料的晶体结构，结果显示为无定形态。这一部分的关键是优化合成条件（如配体与金属离子浓度比、pH值），并获得形貌均一、尺寸可控（约58.9 nm，TEM）的球形纳米颗粒。
2. 通用封装能力的验证 研究样本制备：为验证ZFh-DGR的通用负载能力，研究选择了四类性质不同的模型“货物”：疏水性化疗药物多柔比星（Doxorubicin, DOX）、亲水性蛋白质分子（荧光素标记的卵清蛋白，FITC-OVA）、带负电荷的金纳米颗粒（Gold Nanoparticles, GNPs）和带正电荷的金纳米棒（Gold Nanorods, GNRs）。 实验流程：采用与ZFh-DGR合成相同的一锅法，在调节pH值前将上述“货物”分别加入反应体系，一步法制备得到负载不同物质的ZFh-DGR复合材料（ZFh-DGR/DOX, ZFh-DGR/FITC-OVA, ZFh-DGR/GNPs, ZFh-DGR/GNRs）。 分析方法：通过TEM观察负载后材料的形貌变化（如GNRs被ZFh-DGR外壳包裹）。通过离心纯化后，分别使用荧光光谱检测DOX和FITC-OVA的信号，使用紫外-可见光谱（UV-Vis）检测GNPs和GNRs的等离子体吸收峰，以证明“货物”被成功封装而非简单吸附在表面。同时，测定了ZFh-DGR/DOX和ZFh-DGR/FITC-OVA的药物负载量（DLC）和负载效率（DLE），分别为5.4±0.1% / 77.5±1.2% 和 6.9±0.1% / 86.4±1.6%。DLS和Zeta电位数据显示负载不同货物后材料尺寸和电位无显著差异，进一步支持了封装发生在框架内部孔隙的结论。
3. 体外性质研究（以ZFh-DGR/DOX为模型） 稳定性测试：将ZFh-DGR/DOX分散在不同介质中（不同pH的PBS缓冲液、高盐PBS、含血清的细胞培养基），在37°C下孵育10小时，通过DLS监测其流体力学直径随时间的变化，评估其在不同生理环境下的胶体稳定性。 pH响应性药物释放：将ZFh-DGR/DOX分散在不同pH值（7.4, 6.8, 5.5）的PBS中，在37°C下进行体外释放实验。在不同时间点取样、离心，通过荧光光谱测定上清液中DOX的浓度，计算累积释放率，研究其pH响应释放行为。 生物相容性评估：通过溶血实验评估材料的安全性。将不同浓度的ZFh、ZFh-DGR、ZFh/DOX、ZFh-DGR/DOX与大鼠红细胞共孵育3小时，测定上清液在570 nm处的吸光度，计算溶血率。 细胞摄取机制研究：使用肝细胞癌HepG2细胞，分别用网格蛋白介导的内存作用抑制剂（氯丙嗪）、小窝蛋白介导的内存作用抑制剂（染料木素）和巨胞饮作用抑制剂（渥曼青霉素）预处理细胞1小时，然后加入负载荧光素（FITC）的ZFh-DGR（ZFh-DGR/FITC）孵育3小时。通过流式细胞术检测细胞内FITC的荧光强度，分析主要的细胞摄取途径。 体外细胞毒性及选择性评估： * 细胞系：使用高表达ανβ3整合素的肝癌细胞（HepG2）和低表达该整合素的正常肝细胞（L02）。 * 实验分组：设置游离DOX、ZFh/DOX（无靶向肽）、ZFh-DGR/DOX（有靶向肽）以及空白材料对照组。 * 方法：将不同浓度的上述制剂与细胞共孵育24小时，采用MTT法测定细胞存活率，计算半数抑制浓度（IC50）。 * 细胞摄取可视化与定量：通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察L02和HepG2细胞对ZFh-DGR/FITC的摄取差异。通过流式细胞术定量比较不同细胞系对不同制剂（游离FITC、ZFh/FITC、ZFh-DGR/FITC）的摄取效率。
4. 体内抗肿瘤疗效与安全性评估 动物模型：建立皮下荷Heps肝癌的ICR小鼠模型。 实验分组与给药：将小鼠随机分为5组（n=5/组）：生理盐水组、ZFh-DGR组、游离DOX·HCl组、ZFh/DOX组、ZFh-DGR/DOX组。以5 mg DOX/kg的剂量，通过尾静脉注射给药，每2天一次，共给药6次。 疗效与安全性指标监测： * 肿瘤生长：定期测量肿瘤体积，计算相对肿瘤体积（RTV）。 * 体重变化：定期监测小鼠体重，评估系统毒性。 * 生存分析：记录各组小鼠的生存时间，绘制生存曲线。 * 组织病理学分析：治疗结束后（第10或12天），处死小鼠，取肿瘤组织和主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）。对组织进行石蜡包埋、切片，分别进行苏木精-伊红（H&E）染色和TUNEL（原位末端标记）染色，在光学显微镜下观察肿瘤坏死、细胞凋亡情况及主要器官的病理损伤。
主要研究结果
1. 材料成功构建并具备靶向修饰能力：成功合成了球形、尺寸均一的ZFh纳米框架（~58.9 nm）。FT-IR和Zeta电位数据证实，通过一锅法成功将靶向肽Fmoc-HDGR掺杂进入ZFh框架，形成ZFh-DGR，且肽的掺杂比例（10%，20%）对材料形貌和尺寸影响很小，表明该方法具有良好的可控性和灵活性。
2. 展示出卓越的通用封装能力：TEM、荧光光谱和UV-Vis光谱结果明确显示，疏水的DOX、亲水的FITC-OVA、带负电的GNPs和带正电的GNRs均能被成功封装进ZFh-DGR框架中。这表明ZFh-DGR框架兼具的疏水（Fmoc基团）和亲水（组氨酸）区域，使其能够兼容并封装性质迥异的物质，解决了传统MOFs负载类型单一的问题。
3. 具备理想的体外理化与生物学特性： * 稳定性与pH响应性：ZFh-DGR在生理条件、高盐和含血清培养基中均表现出良好的稳定性。在酸性环境中（pH 6.5, 6.0, 5.5），其尺寸显著增大并逐渐降解，这是由于组氨酸在酸性条件下质子化，破坏了与Zn²⁺的配位键。相应地，体外释放实验证实ZFh-DGR/DOX具有明显的pH响应性药物释放行为，在模拟肿瘤微环境（pH 6.8）和溶酶体环境（pH 5.5）下，DOX释放显著加快（24小时释放率分别为48.9%和78.1%），而在生理pH 7.4下释放较慢（35.7%）。 * 高生物相容性：溶血率低于1%，表明材料具有良好的血液相容性。 * 主动靶向与细胞选择性：细胞摄取机制研究表明，ZFh-DGR主要通过网格蛋白介导的内存作用进入细胞。细胞毒性实验显示，对于低表达ανβ3整合素的正常L02细胞，无论是否掺杂靶向肽（ZFh/DOX vs. ZFh-DGR/DOX），DOX制剂的细胞毒性均较低（细胞存活率>75%），而游离DOX表现出高毒性（IC50 = 6.58 μg/ml）。相反，对于高表达ανβ3整合素的HepG2细胞，ZFh-DGR/DOX表现出最强的细胞毒性（IC50 = 1.79 μg/ml），显著优于游离DOX（IC50 = 4.76 μg/ml）和无靶向的ZFh/DOX（IC50 = 3.33 μg/ml）。CLSM和流式结果直观且定量地证实了ZFh-DGR/FITC在HepG2细胞中的摄取量远高于L02细胞（7.3倍），且在HepG2细胞中，ZFh-DGR的摄取量是ZFh的1.7倍。这些结果有力证明了DGR肽赋予了ZFh-DGR对ανβ3整合素过表达肿瘤细胞的主动靶向能力和高选择性。
4. 在体内展现出高效低毒的精准治疗潜力： * 抗肿瘤疗效：在荷瘤小鼠模型中，ZFh-DGR/DOX治疗组表现出最佳的肿瘤抑制效果。治疗12天后，其相对肿瘤体积（RTV=5.72）显著小于游离DOX组（RTV=16.77）和ZFh/DOX组（RTV=8.72），肿瘤重量也最轻。 * 系统毒性：游离DOX组小鼠体重显著下降，显示严重的系统毒性。而ZFh-DGR/DOX组小鼠体重稳步上升，生存率最高（80%），表明其具有优异的生物安全性。 * 组织病理学证据：H&E和TUNEL染色显示，ZFh-DGR/DOX组肿瘤组织中坏死区域最大、细胞凋亡最显著。主要器官的病理切片显示，ZFh-DGR/DOX组未引起明显病变，而游离DOX组则观察到心肌细胞损伤和肾脏出血区域。这从组织层面证实了ZFh-DGR/DOX在实现高效抑瘤的同时，有效避免了传统化疗药的脱靶毒性。
研究结论与价值
本研究成功开发了一种基于氨基酸衍生物和靶向肽的、可通过一锅法制备的肽掺杂生物金属有机框架（ZFh-DGR）。该工作系统性证明，ZFh-DGR是一个集通用封装、主动靶向、pH响应释放和高生物相容性于一体的多功能纳米递送平台。其科学价值在于：1) 提出了一种简单、通用的策略，通过使用带保护基的氨基酸配体和共掺杂肽，一举解决了bio-MOFs的靶向修饰和通用负载两大难题；2) 深入揭示了该材料的结构-功能关系，如Fmoc基团与组氨酸分别贡献的疏水/亲水作用、组氨酸-Zn²⁺配位键赋予的pH响应性、以及DGR肽介导的ανβ3整合素靶向性；3) 为构建“从头设计”（de novo）的精准纳米药物平台提供了新思路和新方法。
其应用价值突出表现在：作为一种高效低毒的纳米药物载体，ZFh-DGR/DOX在肝癌治疗中实现了显著的肿瘤靶向富集、微环境触发释药和减毒增效，展现了巨大的临床转化潜力。该平台还可拓展用于负载其他药物（如蛋白质、核酸）、成像探针，或通过掺杂多种功能肽实现更复杂的诊疗一体化或联合治疗。
研究亮点