本研究由胡珊珊（第一作者及通讯作者，遵义医科大学附属医院）、彭小佳、夏兵、顾慈航、孙宝飞、常敏、丁久阳以及彭龙英（共同通讯作者，遵义医科大学附属医院）共同完成，研究论文发表于Cell Death Discovery期刊（2025年，第11卷，第478期）。
本研究的学术领域聚焦于神经退行性疾病与血管疾病的交叉学科，具体探讨动脉粥样硬化（Atherosclerosis, AS）与帕金森病（Parkinson’s disease, PD）之间的病理联系。研究背景基于几个关键科学发现：首先，AS与PD在流行病学上存在关联，两者共享炎症、胆固醇稳态失衡等病理生理过程。其次，载脂蛋白E ε4等位基因（Apolipoprotein E epsilon 4 allele, APOE4）是AS和PD共同的风险遗传因子。然而，APOE4携带者是否在黑质（Substantia nigra pars compacta, SNpc）区域表现出更高的磷酸化Tau蛋白（phosphorylated tau, p-tau）水平，以及AS相关的病理是否与PD样的Tau蛋白病变存在直接关联，此前尚不明确。因此，本研究旨在揭示APOE4是否通过影响胆固醇代谢，进而促进黑质区Tau蛋白过度磷酸化，从而在AS与PD样神经退行之间建立直接的病理机制联系。
研究的详细工作流程包含多个相互衔接的步骤，综合运用了人体尸检样本分析、基因工程小鼠模型、细胞分子生物学实验及行为学评估。
第一步骤：人体尸检样本分析。 研究团队从贵州医科大学法医学院获取了共计26例尸检样本，包括大脑黑质组织和冠状动脉。样本根据APOE基因型和是否患有AS分为四组：APOE4-非AS对照组、APOE4- AS组、APOE4+非AS对照组、APOE4+ AS组。对冠状动脉进行苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin， HE）染色以评估动脉粥样硬化斑块和狭窄程度。对大脑黑质组织进行系统的免疫组织化学（Immunohistochemistry， IHC）染色分析，使用的抗体包括：酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase， TH，用于标记多巴胺能神经元）、胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein， GFAP，用于标记星形胶质细胞）、离子钙接头蛋白-1（Ionized calcium-binding adapter molecule 1， Iba-1，用于标记小胶质细胞）、AT8抗体（识别p-tau的Ser202和Thr205位点）、pSer396 Tau抗体以及pSer129 α-突触核蛋白（α-synuclein）抗体。此外，还使用蛋白质印迹法（Immunoblotting， IB）定量分析了黑质组织中多种位点（AT8， pSer396， pSer129 α-synuclein等）的p-tau水平以及多巴胺转运体（Dopamine transporter， DAT）和TH的蛋白表达量。此步骤旨在确认在AS患者，特别是APOE4携带者中，是否存在黑质多巴胺能神经元丢失、神经炎症、α-synuclein病理以及更关键的Tau蛋白过度磷酸化。
第二步骤：构建并分析AS小鼠模型。 研究采用APOE3/3和APOE4/4基因敲入小鼠（分别简称APOE3和APOE4小鼠）作为实验对象。通过给10月龄小鼠喂食高脂饮食（High fat diet, HFD）4个月来模拟AS病理，形成APOE3-HFD和APOE4-HFD组，同时设置正常饮食（Normal diet, ND）对照组。首先通过HE染色评估小鼠主动脉的病变程度。随后，聚焦于黑质区域：使用免疫荧光（Immunofluorescence， IF）双标技术（TH与AT8或pSer396 Tau共标）检测多巴胺能神经元内的p-tau积累；通过蛋白质印迹法系统检测黑质组织中多个磷酸化位点（AT8, pSer396， pSer202， pSer404， pThr231， pThr205， pThr217等）的Tau蛋白水平。此步骤旨在验证动物模型中APOE4和HFD是否协同导致黑质区Tau蛋白病变。
第三步骤：评估小鼠黑质纹状体通路完整性及运动功能。 对上述小鼠模型，通过TH的免疫荧光和免疫组化染色，定量分析黑质SNpc区域TH阳性神经元数量以及纹状体（Caudate putamen， CPU）区域TH阳性纤维的密度。同时，通过蛋白质印迹法检测SNpc和CPU组织中TH的蛋白表达水平。为了评估功能学后果，研究进行了两种行为学测试：杆测试（Pole test， 测量小鼠从杆顶爬至底部的时间，评估运动迟缓和协调性）和转棒测试（Rotarod test， 测量小鼠在加速旋转棒上的停留时间，评估运动平衡和耐力）。此步骤旨在探究Tau蛋白病理是否伴随多巴胺能神经退行和运动功能障碍。
第四步骤：探究胆固醇的作用机制。 首先，在动物水平，使用Filipin荧光染色检测小鼠黑质区域的胆固醇积累情况，并测定血清中的总胆固醇和游离胆固醇含量。其次，在细胞水平，从新生APOE3和APOE4小鼠中分离培养原代中脑神经元，并用不同浓度的胆固醇进行处理。通过蛋白质印迹法分析神经元内多种p-tau位点的变化。鉴于糖原合成酶激酶3β（Glycogen synthase kinase 3 beta， GSK3β）是已知的Tau蛋白关键激酶，研究进一步检测了胆固醇处理后原代神经元中GSK3β在Tyr216位点的磷酸化（pY216 GSK3β， 其活性形式）水平。同时，也在APOE4-HFD小鼠和APOE4+ AS患者脑组织中验证了pY216 GSK3β的水平。此步骤旨在阐明胆固醇是否通过激活GSK3β来驱动Tau蛋白的过度磷酸化。
第五步骤：干预实验验证治疗潜力。 基于胆固醇积累触发病理的假设，研究使用2-羟丙基-β-环糊精（2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin， 2HPβCD）进行干预，该物质可促进细胞内胆固醇的外排。对APOE4-HFD小鼠进行为期8周的2HPβCD皮下注射。干预后，重新评估以下指标：黑质区p-tau水平（免疫荧光和蛋白质印迹）、GSK3β活性、胆固醇积累（Filipin染色和血清检测）、黑质纹状体TH表达（免疫染色和蛋白质印迹）以及运动功能（杆测试和转棒测试）。此外，也评估了2HPβCD对主动脉AS斑块的影响。此步骤旨在证实降低胆固醇是否能逆转或缓解AS小鼠模型中的PD样病理和运动缺陷。
数据分析流程：所有定量数据均以均值±标准误表示。根据数据组别，采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8进行统计分析。两组间比较使用非配对学生t检验（Unpaired Student’s t test），多组间比较（考虑基因型和饮食处理两个因素）采用双因素方差分析（Two-way ANOVA），并辅以Bonferroni事后检验。P值小于0.05被认为具有统计学显著性。所有行为学测试和病理学分析均在研究者对分组情况不知情的条件下进行。
本研究取得了系统性且逻辑连贯的主要结果：
在人体样本分析中，结果发现：APOE4+ AS患者的冠状动脉狭窄程度显著高于APOE4- AS患者。更重要的是，在脑组织层面，与APOE4- AS患者相比，APOE4+ AS患者的黑质区表现出更严重的多巴胺能神经元（TH+细胞）丢失、更活跃的星形胶质细胞（GFAP+）和小胶质细胞（Iba-1+）增生、更高水平的pSer129 α-synuclein以及显著升高的AT8阳性信号（p-tau）和pSer396 Tau水平。蛋白质印迹结果进一步证实，APOE4+ AS患者黑质中多个位点的p-tau水平更高，而DAT和TH蛋白表达则更低。这些结果首次直接证明，在AS患者中，特别是APOE4携带者，其黑质区已存在典型的PD相关病理，包括Tau蛋白过度磷酸化。这为后续动物模型研究提供了坚实的人类病理学依据。
在AS小鼠模型中，结果与人体发现高度一致：APOE4-HFD小鼠的主动脉病变比APOE3-HFD小鼠更严重。免疫荧光显示，APOE4-HFD小鼠黑质的多巴胺能神经元内AT8和pSer396 Tau信号显著增强。蛋白质印迹分析揭示，APOE4-HFD小鼠黑质中几乎所有检测的p-tau位点（AT8， pSer396， pSer202， pSer404， pThr231， pThr205， pThr217等）水平均显著高于APOE3-HFD小鼠，而总Tau蛋白水平无差异，表明是磷酸化过程被特异性增强。这些结果成功在动物模型中复现了APOE4和AS环境（HFD）共同促进黑质Tau蛋白病变的现象。
对小鼠黑质纹状体通路和运动功能的评估显示：APOE4-HFD小鼠的黑质TH+神经元数量和纹状体TH+纤维密度均显著减少，TH蛋白表达也相应下降。在行为学上，APOE4-HFD小鼠在杆测试中下落时间显著延长，在转棒测试中跌落潜伏期显著缩短，表明存在明显的运动迟缓和平衡协调障碍。这些结果将分子水平的Tau蛋白病理与细胞层面的多巴胺能神经退行以及个体层面的运动功能障碍联系起来，形成了一个完整的病理链条。
机制探究结果提供了关键的分子解释：Filipin染色显示APOE4-HFD小鼠黑质区胆固醇积累显著多于APOE3-HFD小鼠，其血清总胆固醇和游离胆固醇水平也更高。在原代神经元实验中，胆固醇处理能显著诱导APOE4神经元产生比APOE3神经元更强烈的多p-tau位点升高。机制上，胆固醇处理以浓度依赖的方式激活了GSK3β（pY216 GSK3β水平升高）。同样，在APOE4-HFD小鼠和APOE4+ AS患者脑组织中，pY216 GSK3β的水平也显著上调。这些结果清晰地证明，APOE4基因型在AS/HFD环境下导致胆固醇积累，进而激活GSK3β激酶，最终引发Tau蛋白的过度磷酸化。
最后的干预实验结果为潜在治疗策略提供了概念验证：使用2HPβCD治疗后，APOE4-HFD小鼠黑质区的胆固醇积累减少，p-tau水平显著下降，GSK3β活性被抑制，同时TH和DAT蛋白表达得到恢复。病理学上，黑质和纹状体的TH阳性信号有所回升。功能学上，小鼠在杆测试和转棒测试中的表现得到显著改善。此外，主动脉的AS病变也有所减轻。这一系列结果强有力地证明，通过药物手段促进胆固醇转运、降低其积累，能够同时缓解AS小鼠模型中的动脉粥样硬化病理、黑质Tau蛋白病变、多巴胺能神经退行以及运动行为缺陷。
基于以上结果，本研究得出明确结论：APOE4是连接动脉粥样硬化与帕金森样Tau蛋白病变的关键遗传风险因子。其机制在于，APOE4在AS（如高脂饮食）条件下，导致黑质区域神经元胆固醇积累，进而激活GSK3β激酶，引发Tau蛋白的过度磷酸化。这种Tau蛋白病理进一步导致黑质纹状体多巴胺能神经退行和运动功能障碍。靶向胆固醇代谢（如使用环糊精类药物促进其外排）可以同时缓解AS病理和PD样的神经退行性病变。
本研究的科学价值与应用意义重大。在科学价值层面：1）建立了新的疾病关联机制：首次在人体和动物模型上系统地证明了AS与PD样Tau蛋白病变之间存在直接的、APOE4和胆固醇依赖的病理联系，为理解这两种常见老年疾病的共病机制提供了全新视角。2）阐明了详细的分子通路：从基因型（APOE4）到代谢异常（胆固醇积累），再到激酶激活（GSK3β）和底物修饰（Tau磷酸化），最后到细胞退行和功能丧失，描绘了一条清晰的致病链条。3）拓展了对PD病理的认识：强调了在PD病理中，除α-synuclein外，Tau蛋白的作用，尤其是在有AS和APOE4背景的亚群中可能至关重要。在应用价值层面：1）提出了新的治疗靶点：研究表明胆固醇-GSK3β轴是一个潜在的干预节点。2）验证了干预策略的可行性：使用2HPβCD的干预实验提供了“一石二鸟”的治疗概念，即通过调节胆固醇可能同时防治AS和PD。3）具有精准医学意义：提示APOE4携带的AS患者可能是发生PD样神经退行的高危人群，需要早期监测和针对性干预。
本研究的亮点突出：重要发现方面：首次在AS患者脑内发现并证实了APOE4依赖的黑质Tau蛋白病理，并将其与胆固醇代谢和GSK3β激活机制直接挂钩。研究方法的系统性：工作流程设计严谨，从人类尸检样本到转基因动物模型，再到原代细胞机制探索和最终的药理干预验证，形成了完整而有力的证据链。研究对象的特殊性：聚焦于APOE4这一共同风险因子和胆固醇这一共同代谢环节，巧妙地将心血管系统与中枢神经系统的疾病联系起来，体现了交叉学科研究的创新性。
此外，研究团队也客观指出了本研究的局限性，例如未来需要通过蛋白质组学等高通量方法筛选其他可能受胆固醇调控的Tau相关激酶或磷酸酶，以及需要纳入性别因素进行分析以消除潜在偏差。这些为后续更深入的研究指明了方向。这项研究为AS与PD的共病机制提供了开创性见解，并为开发同时针对这两种疾病的共同治疗策略奠定了重要的理论和实验基础。