本研究由南京医科大学附属肿瘤医院、江苏省肿瘤医院免疫学系的胡楚鹏（Chupeng Hu）和尤文华（Wenhua You）作为共同第一作者完成，通讯作者为东南大学附属中大医院的滕皋军（Gao-jun Teng）教授和南京医科大学的陈云（Yun Chen）教授。该研究工作于2026年10月12日在线发表于 Cancer Cell 期刊（第44卷，第1–18页）。
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一。尽管免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade，ICB）疗法在多种恶性肿瘤中显示出显著疗效，但其在HCC中的临床获益仍然有限。肿瘤相关免疫微环境中的三级淋巴结构（tertiary lymphoid structures，TLSs）被认为是抗肿瘤免疫的关键参与者，且与多种癌症类型的免疫治疗正应答相关。然而，TLS在HCC中的预测价值存在争议——部分TLS丰富的患者仍然对治疗无应答，提示TLS内部存在功能异质性，可能只有特定的免疫微环境亚型真正决定免疫治疗疗效。因此，识别能够准确预测ICB应答的特定免疫生态位（immune niche）及其调控机制，对于提高HCC免疫治疗效果具有重要意义。
本研究旨在利用空间多组学分析揭示HCC中TLS功能异质性的细胞与分子基础，鉴定真正驱动免疫治疗应答的关键免疫微环境，并进一步探究肿瘤内微生物群是否以及如何调控这些免疫生态位的形成与功能。
本研究采用了多层次的实验设计，涵盖临床样本分析、空间多组学技术、动物模型验证以及深入的分子机制探究。
第一部分：临床样本的空间多组学分析与SLN鉴定。 研究者首先收集了来自两个临床中心（JSPH和WXPH）的50例HCC患者样本，通过多重免疫荧光染色分析TLS分布。同时利用空间转录组数据解析TLS区域在应答者（responders）与非应答者（non-responders）之间的差异表达基因，鉴定出富含T细胞干性调控因子（如TCF7和ETS1）的基因特征。进一步，研究者运用42标记的成像质谱流式（imaging mass cytometry，IMC）技术，对12例接受ICB治疗的HCC患者FFPE切片进行全切片染色，捕获了42个含TLS区域。通过无监督聚类和细胞邻域（cellular neighborhoods，CNs）分析，鉴定出由2型固有淋巴细胞（type 2 innate lymphoid cells，ILC2s）与TCF-1+前体耗竭T细胞（progenitor exhausted T cells，Tpex）共同构成的特殊免疫生态位，命名为“干细胞样淋巴微环境”（stem-like lymphoid niches，SLNs）。
第二部分：肿瘤内微生物群与SLN丰度的关联分析。 对46例初治HCC患者的肿瘤组织进行16S rRNA测序，比较SLN高密度与低密度肿瘤之间的微生物组成差异。通过荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）和距离基础的空间分布分析，验证特定菌种在SLN内的优先定植。在Hepa1-6和H22原位肝癌小鼠模型中评估该菌株对SLN丰度和肿瘤进展的功能影响。
第三部分：ILC2s在SLN形成与Tpex维持中的功能验证。 利用流式细胞术和多重免疫荧光检测b. cereus处理后ILC2频率及CD70和LTα表达变化。构建ILC2缺陷小鼠（Il7rCre/+ Rorafl/fl），评估ILC2缺失对SLN密度、Tpex频率以及αPD-L1治疗应答的影响。通过体外共培养实验验证ILC2s通过CD70-CD27信号轴维持T细胞干性的机制，并通过Lta敲除（Lta-/-）ILC2的过继转移实验验证ILC2来源的LTα在体内的作用。
第四部分：内皮细胞IL-33信号在SLN积累中的作用。 通过空间转录组和多色免疫荧光确定IL-33在SLN内的表达定位（以内皮细胞为主）。构建Il33-/-转基因小鼠，评估IL-33缺失对b. cereus诱导的ILC2激活、SLN丰度及Tpex维持的影响。进一步利用AAV-shIl33实现内皮细胞特异性Il33沉默，验证内皮细胞来源的IL-33在该过程中的关键性。
第五部分：IL-33调控ILC2s的代谢-表观遗传机制。 采用Smart-seq分析Il33-/-与野生型小鼠肿瘤浸润ILC2s的转录组差异，发现线粒体代谢相关基因显著下调。通过透射电镜、线粒体功能染色和代谢流分析（13C-葡萄糖示踪）评估IL-33对ILC2s线粒体代谢的调控。利用CUT&Tag技术分析H3K4me3组蛋白修饰在CD70、LTA和LTB基因启动子区域的富集差异，并通过KDM5去甲基化酶活性实验和药理学抑制实验验证该表观遗传调控机制。
第六部分：b. cereus效应分子PI-PLC的鉴定与机制解析。 通过热灭活（heat-killed，HK）b. cereus与活菌的对比实验确定效应依赖于活菌的代谢活性。构建plcA基因缺失突变株（ΔplcA），比较野生型与突变株在诱导内皮细胞IL-33释放和促进SLN积累方面的差异。在内皮细胞中检测PI-PLC对CD55（GPI锚定蛋白）的切割、补体激活产物C3a/C5a的生成、第二信使IP3/DAG水平以及钙离子依赖的calpain信号通路的激活情况。
第七部分：PI-PLC与αPD-L1联合治疗的疗效评估。 在Hepa1-6原位肝癌模型中，比较PI-PLC单药、αPD-L1单药及联合治疗对肿瘤负荷、ILC2激活、CD8+ T细胞效应功能和Tpex干细胞性的影响。
SLN的鉴定及其与免疫治疗应答的关联。 空间转录组分析发现，应答者TLS区域高表达T细胞干性相关基因（TCF7、ETS1等）。IMC分析进一步鉴定出一个由ILC2s和TCF-1+ Tpex细胞共定位构成的独特细胞邻域（CN1/CN3），该结构在应答者中显著富集。与常规TLS不同，SLN中Tpex与巨噬细胞和LAMP3+树突状细胞的邻近关系在所有TLS类型中均存在，而ILC2-Tpex的紧密共定位则是SLN的特有特征。此外，SLN富含IgG+浆细胞而非IgA+浆细胞，且SLN高评分患者复发率更低，TCR基因活性更高。独立临床队列验证了SLN基因特征对免疫治疗应答的预测价值。
b. cereus与SLN丰度的正相关性。 16S rRNA测序显示，SLN高密度肿瘤中芽孢杆菌属（Bacillus spp.）丰度显著升高，种水平鉴定确认其主要为蜡样芽孢杆菌组（Bacillus cereus group，b. cereus）。FISH和距离分析证实b. cereus优先定植于SLN区域内部，而非瘤周或远端区域。在SLN高密度HCC肿瘤中，70%可培养出活菌，而SLN低密度肿瘤中仅10%可培养出。原位肝癌小鼠模型中，b. cereus灌胃后可成功定植于肿瘤组织，显著增加SLN丰度、升高CD8+ T细胞中TCF-1表达、减少PD-1+Tim-3+终末耗竭T细胞，并抑制肿瘤生长。联合b. cereus与αPD-L1治疗进一步增强了抗肿瘤免疫效应。
ILC2s以IL-33依赖性方式促进SLN积累。 b. cereus处理后，肿瘤内ILC2频率显著增加，CD70和LTα表达上调。ILC2缺陷小鼠中，b. cereus无法抑制肿瘤生长或增加SLN密度，Tpex频率也显著降低，且对αPD-L1治疗的应答受损。体外共培养实验证明ILC2s通过CD70-CD27信号轴维持T细胞TCF-1表达。Lta-/- ILC2的过继转移实验进一步证实ILC2来源的LTα对SLN形成和Tpex维持的贡献。
内皮细胞IL-33在b. cereus诱导SLN中的关键作用。 空间转录组和免疫荧光确认IL-33主要由SLN内的内皮细胞表达。b. cereus处理可显著增加内皮细胞IL-33表达。Il33-/-小鼠中，b. cereus无法诱导ILC2的CD70和LTα表达上调，SLN密度降低，Tpex频率减少，肿瘤进展加速。AAV-shIl33介导的内皮细胞特异性Il33沉默重现了类似表型，证实内皮细胞来源的IL-33在该轴中的必要性。
IL-33通过代谢-表观遗传重编程激活ILC2s。 Smart-seq分析显示Il33-/- ILC2s中CD70、LTA和LTB表达下调，线粒体呼吸链复合物相关基因显著降低。代谢流分析表明IL-33处理增加了谷氨酸M+2（而非谷氨酰胺M+2），降低了α-KG/琥珀酸比值，提示α-KG向谷氨酸的转化增强。CUT&Tag分析发现野生型小鼠ILC2s在CD70、LTA和LTB基因位点存在显著的H3K4me3富集，而Il33-/-小鼠中该修饰显著减少。IL-33刺激可降低KDM5去甲基化酶活性，药理学抑制H3K4me3可阻断IL-33诱导的CD70和LTα表达。
b. cereus来源的PI-PLC是驱动IL-33释放的效应分子。 热灭活b. cereus无法抑制肿瘤生长或增加SLN丰度，而野生型活菌的细菌培养上清（bacteria-free supernatant，BFS）可诱导内皮细胞IL-33释放，ΔplcA突变株的BFS则无此效应。在无菌小鼠中，野生型b. cereus抑制肿瘤生长并增加SLN丰度，而ΔplcA突变株无此效应。机制上，PI-PLC通过切割内皮细胞表面GPI锚定蛋白CD55，激活补体替代途径，产生C3a/C5a，进而激活C3aR/C5aR-PLCβ信号轴，升高IP3和DAG水平，触发细胞内钙动员和calpain依赖的IL-33释放。C3aR和C5aR的敲低可显著减弱PI-PLC诱导的IL-33上调。
PI-PLC与αPD-L1的协同抗肿瘤效应。 在原位肝癌模型中，PI-PLC单药和αPD-L1单药均能中等程度减轻肿瘤负荷，而联合治疗产生了更优的抗肿瘤效果。联合治疗组ILC2频率和LTα表达显著升高，CD8+ T细胞的IFN-γ和TNF-α产生能力增强，TCF-1表达升高，PD-1+Tim-3+终末耗竭T细胞频率降低。重组IL-33（rIL-33）与αPD-L1的联合治疗也显示出类似的协同效应。
本研究系统揭示了HCC中TLS功能异质性的细胞和分子基础，鉴定出以CD70+ ILC2s与TCF-1+ Tpex细胞共定位为特征的SLNs，该结构是预测PD-1/PD-L1免疫治疗应答的独立指标。研究进一步阐明了肿瘤内b. cereus通过其分泌的PI-PLC切割内皮细胞CD55、激活补体-C3a/C5a-Ca2+-calpain信号轴，促进内皮细胞释放IL-33。IL-33通过代谢重编程降低α-KG/琥珀酸比值、抑制KDM5活性，增强CD70、LTA和LTB基因启动子区域的H3K4me3修饰，从而驱动ILC2s获得SLN诱导表型，维持Tpex细胞干性并增强抗肿瘤免疫。
本研究的科学价值在于：（1）首次定义了SLN这一功能独特的免疫生态位，超越传统TLS的形态学分类，为精准预测免疫治疗应答提供了新的生物标志物；（2）揭示了微生物群-内皮细胞-ILC2-Tpex之间的多层级调控网络，将肿瘤内微生物组的免疫调节功能与特定免疫生态位的形成机制联系起来；（3）阐明了IL-33通过代谢-表观遗传轴调控ILC2s功能的分子机制，为理解ILC2s在肿瘤免疫中的上下文依赖性作用提供了新视角。
在应用转化方面，本研究提示PI-PLC或rIL-33与αPD-L1的联合策略可能成为增强HCC免疫治疗疗效的可行方案。然而，鉴于b. cereus的条件致病性和PI-PLC广泛的生物学活性，其临床转化前仍需进行充分的安全性评估。
本研究的核心亮点包括：（1）利用空间多组学整合分析，从临床样本中鉴定出SLNs作为免疫治疗应答的关键预测因子，解决了TLS丰度无法准确预测疗效的临床困境；（2）发现肿瘤内b. cereus通过PI-PLC-CD55-补体-IL-33信号轴驱动SLN积累，建立了特定微生物种属与免疫微环境重塑之间的因果联系；（3）揭示了IL-33通过α-KG/琥珀酸代谢轴调控KDM5活性，进而影响H3K4me3在CD70、LTA和LTB基因启动子区域沉积的表观遗传机制，为ILC2s的功能调控提供了新的分子解释；（4）验证了PI-PLC与αPD-L1联合治疗在HCC中的协同抗肿瘤效果，为微生物来源分子辅助免疫治疗提供了概念验证。
研究还观察到SLN富含IgG+浆细胞而非IgA+浆细胞，提示SLN可能通过抗体依赖性机制参与持续的抗原呈递和免疫应答。SLN高评分患者中TP53突变率较高，但该突变与肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）无显著关联，提示SLN的形成可能独立于TMB相关的免疫原性机制。此外，巨噬细胞也被发现是IL-33的另一来源，可能在ILC2依赖性反馈环路中维持已建立TLS内的IL-33水平。研究数据可通过GSA（CRA026534）和GSA-Human（HRA010073）数据库获取，分析代码公开于GitHub（https://github.com/youwh1996/hcc_icb_ilc2/）。