学术研究报告：NAT10介导的mRNA N4-乙酰胞苷通过重编程丝氨酸代谢驱动急性髓系白血病的发生与干细胞特性
一、 主要作者、机构及发表信息
本研究是由多所中国研究机构合作完成。人白血病样本收集自中山大学肿瘤防治中心（SYSUCC）和福建医科大学附属协和医院。细胞实验、分子机制探索及大部分数据分析工作由相关团队完成。文中特别鸣谢了Jianjun Chen博士（希望之城）提供的MLL-ENL-ERtm细胞系。研究最终以题为《nat10-mediated mrna n4-acetylcytidine reprograms serine metabolism to drive leukaemogenesis and stemness in acute myeloid leukaemia》的论文形式，发表于《Nature Cell Biology》期刊。由于提供的文本为文章的补充信息（Supplementary Information），故未包含确切的作者列表和出版日期，但根据期刊和内容可判断为一项原创性研究。
二、 学术背景与研究目标
本研究属于肿瘤学，特别是白血病表观转录组学领域。急性髓系白血病（AML）是一种侵袭性血液肿瘤，其发生发展与异常的基因表达调控密切相关。近年来，RNA修饰作为表观转录组学的核心，被发现在多种生物学过程中起关键作用。N4-乙酰胞苷（ac4C）是一种进化上保守的RNA修饰，由N-乙酰转移酶10（NAT10）催化形成于RNA的胞苷残基上。尽管ac4C在tRNA和rRNA上的功能已有研究，但其在mRNA上的作用，尤其是在肿瘤发生中的角色，尚不完全清楚。此前研究提示ac4C可能影响mRNA稳定性，但其在AML中的具体功能、调控机制及临床意义仍是未知领域。
因此，本研究的核心目标是：探究NAT10介导的mRNA ac4C修饰在AML发生发展中的作用及其分子机制，并评估靶向此通路作为AML治疗策略的潜力。具体而言，研究旨在回答几个关键科学问题：NAT10/ac4C在AML患者样本和细胞系中是否异常表达？ac4C修饰如何全局性地影响AML细胞的转录组和蛋白质组？ac4C修饰通过调控哪些关键靶基因和通路来促进白血病发生和干细胞特性（stemness）？能否开发针对NAT10/ac4C轴的有效治疗策略？
三、 详细研究流程
本研究是一个综合性、多层次的系统性探索，其工作流程严谨而复杂，主要可分为以下几个关键步骤：
第一步：研究体系建立与初步表征 研究首先建立了全面的实验体系。研究对象包括：（1）原代细胞：从5名新诊断的AML患者（3男2女，年龄30-70岁）和3名健康供者（男性）外周血中分离的单个核细胞（MNCs）。（2）细胞系模型：使用了包括U937、NB4、HL-60、MOLM13、Kasumi-1、MonoMac6、THP-1、HEK293T在内的多种人AML细胞系及工具细胞系。所有细胞系均通过STR分析进行鉴定，并定期检测支原体污染。（3）工程细胞模型：使用了MLL-ENL-ERtm永生化白血病细胞，通过添加4-OHT诱导MLL-ENL表达来模拟特定亚型AML。 在此基础之上，研究进行了初步实验：通过定量实时PCR（RT-qPCR）、蛋白质印迹（Western Blot） 和斑点印迹（Dot Blot） 等技术，检测了NAT10在AML样本与正常样本中mRNA和蛋白水平的表达差异，以及整体ac4C RNA修饰水平。这为后续功能研究提供了依据。
第二步：ac4C修饰图谱的全局性绘制与分析 这是本研究的核心方法学部分。为了在全转录组水平精确鉴定ac4C修饰位点，研究团队采用了acRIP-seq（ac4C RNA免疫共沉淀测序） 技术。具体流程如下： 1. 样本处理：从对照或NAT10敲低的MOLM13细胞中提取总RNA。 2. 免疫沉淀：使用特异性抗ac4C抗体富集含有ac4C修饰的RNA片段。 3. 建库测序：对富集到的RNA（IP样本）及对应的输入RNA（Input样本）进行高通量测序。 4. 严格的生物信息学分析流程：这是本研究方法学的亮点。原始数据经Cutadapt修剪后，使用HISAT2比对到人类基因组（hg38）。为减少假阳性，研究引入了关键对照：通过体外转录（IVT）生成完全无修饰的“洁净”RNA，并同样进行acRIP-seq分析。数据分析时，首先过滤掉核糖体RNA（rRNA）的比对、次级比对和非一致配对。然后使用自研的Perl脚本（novel/special method）进行peak calling。其标准非常严格：首先要求位点在两个输入样本中均有至少10条读段覆盖；然后使用DESeq2比较IP与Input样本的归一化读段数，将IP中读段数≥1.5倍且调整后p值<0.05的位点定义为显著位点；接着，为避免非特异性结合等假象，研究者将IVT对照数据的过滤阈值放宽至≥1.2倍，并将实验组中鉴定到的ac4C peaks与IVT对照中鉴定到的peaks进行坐标比对，剔除任何有重叠的区域，从而获得高置信度的ac4C修饰位点。最后，利用HOMER进行motif分析，利用Metascape、GSEA、STRING等工具对ac4C peaks关联的基因进行基因本体（GO）、通路和蛋白质互作网络（PPI）分析。这套流程确保了ac4C位点鉴定的高特异性和可靠性。
第三步：NAT10/ac4C的生物学功能验证 在获得ac4C修饰图谱后，研究通过功能丧失（敲低NAT10）和功能获得（过表达野生型或催化失活突变体NAT10）实验，在多个AML细胞系中验证NAT10/ac4C的生物学功能。使用的关键技术包括： - 细胞增殖/生长分析：采用MTT法、台盼蓝活细胞计数或AO/PI染色进行。 - 细胞凋亡检测：使用膜联蛋白V-FITC/PI凋亡试剂盒，通过流式细胞术（CytoFlex LX）分析。文中补充图1详细展示了用于细胞凋亡和EdU分析的流式细胞术设门策略。 - EdU掺入实验：用于评估细胞DNA合成活性，反映增殖能力。 - RNA稳定性实验：在敲低或对照细胞中使用转录抑制剂放线菌素D（Actinomycin D）处理不同时间点，随后提取RNA并通过RT-qPCR检测特定靶mRNA的衰减速率，计算半衰期，直接验证ac4C对mRNA稳定性的影响。 这些功能实验明确了NAT10/ac4C对AML细胞存活、增殖和凋亡抵抗的关键作用。
第四步：关键下游靶点与通路的机制解析 基于acRIP-seq和差异表达基因分析，研究锁定了一系列受ac4C修饰调控的潜在关键基因。其中，与丝氨酸代谢相关的基因，特别是PHGDH（磷酸甘油酸脱氢酶，丝氨酸合成途径的限速酶）成为重点研究对象。 1. 验证ac4C对PHGDH mRNA的直接调控：通过acRIP-qPCR验证PHGDH mRNA上存在特异的ac4C修饰峰；通过RNA稳定性实验证明NAT10敲低加速PHGDH mRNA降解。 2. 探索ac4C对代谢组的影响：通过定量蛋白质组学（TMT标记结合液相色谱-质谱联用，LC-MS/MS） 分析NAT10扰动后细胞全蛋白表达变化。样品经尿素裂解、还原烷基化、Lys-C和胰蛋白酶序贯酶切后，用TMT 16plex试剂标记，经高效液相色谱（HPLC）分级，最后在Orbitrap Eclipse质谱仪上进行数据依赖性采集（DDA）。数据用Proteome Discoverer软件和SEQUEST HT搜索引擎分析。结果表明，NAT10敲低显著下调了包括PHGDH在内的丝氨酸合成通路蛋白。 3. 代谢功能验证：进一步检测细胞内丝氨酸、甘氨酸等代谢物水平，并使用外源性丝氨酸挽救实验，证明补充丝氨酸可以部分逆转NAT10敲低导致的细胞生长抑制和凋亡增加，从而建立了“NAT10/ac4C → PHGDH mRNA稳定性 → 丝氨酸合成 → AML细胞生存”的因果链条。
第五步：靶向NAT10的治疗潜力评估 本研究不仅局限于机制探索，还积极寻求转化应用价值。 1. 已知抑制剂评估：测试了已知的NAT10化学抑制剂Remodelin，证实其能抑制AML细胞生长、诱导凋亡，并降低ac4C水平和PHGDH表达。 2. 新型抑制剂发现与验证：研究创新性地评估了临床已使用的抗白血病药物氟达拉滨（Fludarabine） 是否靶向NAT10。为此，采用了多种生物物理和细胞生物学方法： - 分子对接（Molecular Docking）：由于人NAT10蛋白结构未知，研究者结合AlphaFold2预测的全长结构和同源建模预测的活性位点结构，生成复合模型。利用Schrödinger软件将氟达拉滨及其磷酸化形式对接到NAT10的预测结合口袋中，从理论上预测其直接结合的可能性。 - 药物亲和响应靶点稳定性（DARTS）实验：这是一种检测小分子与蛋白质直接相互作用的技术。将细胞裂解液与不同浓度氟达拉滨孵育，然后用蛋白酶Pronase消化。如果药物与靶蛋白（NAT10）结合，会保护其不被蛋白酶降解。Western Blot结果显示，氟达拉滨处理组的NAT10蛋白条带强度高于对照组，而对照蛋白ACTB和METTL3不受影响，这强烈提示氟达拉滨能直接结合并稳定NAT10蛋白。 - 细胞热位移分析（CETSA）：在活细胞水平验证药物-靶点相互作用。用氟达拉滨或Remodelin处理细胞后，裂解并加热至不同温度，然后检测NAT10蛋白的残留量。药物结合通常会提高靶蛋白的热稳定性。实验证实，氟达拉滨处理能显著提高NAT10的热稳定性曲线，与DARTS结果相互印证。 - 功能验证：最后，在细胞实验中证明，氟达拉滨能够以剂量依赖性的方式降低细胞内ac4C修饰水平，下调PHGDH表达，并抑制AML细胞生长，其效果与Remodelin或NAT10敲低相似。
四、 主要研究结果
结果一：NAT10/ac4C在AML中高表达且具有促癌功能。 初步表征证实，与正常样本相比，AML患者原代细胞及多种细胞系中NAT10表达和整体ac4C修饰水平显著升高。功能实验表明，敲低NAT10或使用抑制剂Remodelin，能有效抑制AML细胞系的增殖、诱导凋亡，并减少EdU掺入；而过表达野生型NAT10（而非催化失活突变体）则促进细胞生长。这确立了NAT10/ac4C在AML中的致癌作用。
结果二：全局性ac4C修饰图谱揭示了其靶向基因特征及对mRNA稳定性的调控。 通过严谨的acRIP-seq流程，研究在AML细胞中鉴定出数千个高置信度的ac4C修饰位点，这些位点富含特定的序列motif，并倾向于位于mRNA的编码区（CDS）。生物信息学分析显示，ac4C修饰的基因显著富集于代谢过程、细胞周期、DNA复制等与肿瘤生长密切相关的通路。更重要的是，RNA稳定性实验直接证明，NAT10介导的ac4C修饰能够延长其靶mRNA（如PHGDH）的半衰期，从而增加其丰度。这从机制上解释了ac4C如何影响基因表达。
结果三：ac4C通过稳定PHGDH mRNA重编程丝氨酸代谢，是驱动白血病发生的关键环节。 综合acRIP-seq、蛋白质组学和代谢分析数据，PHGDH被确定为ac4C的关键下游靶点。实验证实：（1）PHGDH mRNA上存在特异的ac4C修饰。（2）敲低NAT10会降低PHGDH mRNA稳定性，减少PHGDH蛋白表达。（3）NAT10敲低导致细胞内丝氨酸、甘氨酸等代谢物水平下降。（4）外源性补充丝氨酸可以挽救因NAT10敲低导致的细胞生长抑制和凋亡增加。这一系列结果构成了完整的证据链，阐明了NAT10/ac4C→PHGDH mRNA稳定性→丝氨酸合成通路上调→支持AML细胞增殖/存活的轴线机制。
结果四：氟达拉滨被鉴定为NAT10的新型直接抑制剂，展现出靶向此轴的治疗潜力。 这是本研究的一个重要转化发现。分子对接、DARTS和CETSA三项互补的实验技术共同提供了强有力的证据，表明临床药物氟达拉滨能够直接结合NAT10蛋白。功能上，氟达拉滨处理可模拟NAT10敲低或Remodelin处理的效果：降低细胞内ac4C水平、下调PHGDH表达、并有效抑制AML细胞生长。这为氟达拉滨的抗白血病作用提供了一个全新的作用机制解释，并提示“老药新用”或基于此结构的优化药物开发，是靶向NAT10/ac4C轴的可行策略。
五、 研究结论与价值
本研究的核心结论是：在急性髓系白血病中，RNA乙酰转移酶NAT10通过催化mRNA上的N4-乙酰胞苷（ac4C）修饰，特别是通过稳定丝氨酸合成通路限速酶PHGDH的mRNA，驱动细胞内丝氨酸代谢重编程，从而促进白血病的发生、维持白血病细胞的干细胞特性并抵抗凋亡。这一发现揭示了表观转录组修饰ac4C在AML中的重要致病机制。
其科学价值在于：（1）拓展了对RNA修饰功能的认识：将ac4C的研究从tRNA/rRNA延伸至mRNA，并明确了其在肿瘤代谢 reprogramming中的关键作用。（2）阐明了AML致病的新机制：建立了“RNA修饰-代谢重编程-白血病发生”的新型调控轴，为理解AML的复杂性提供了新视角。（3）提供了新的治疗靶点与策略：NAT10/ac4C/PHGDH轴是一个有潜力的治疗靶标。研究发现临床药物氟达拉滨能直接抑制NAT10，这不仅为其抗白血病作用提供了新解释，也为开发靶向该轴的新型疗法（包括优化氟达拉滨类似物或联合用药）奠定了坚实的理论与实验基础，具有重要的转化医学前景。
六、 研究亮点
七、 其他有价值内容
本研究补充材料中详实的方法描述本身也具有很高价值。例如，文中提供了poly(A) mRNA、rRNA和tRNA的详细纯化方案，以及CUT&RUN、组蛋白乙酰化质谱分析、定量蛋白质组学样品制备等 protocols，这些对于相关领域的研究者来说是宝贵的技术参考。此外，研究中使用和验证的多种AML细胞系及其培养条件（如Kasumi-1需要20% FBS，THP-1等需要特殊添加物），为后续研究者建立实验模型提供了准确信息。