本文属于类型b，即方法学论文，主要介绍单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs）生成的技术更新与标准化操作流程。以下是详细报告：
作者及发表信息
本文由Ahmed Muhsin, Roberto Rangel, Long Vien, Laura Bover（均来自美国University of Texas–M.D. Anderson Cancer Center的单克隆抗体核心设施实验室）撰写，收录于Florencia McAllister主编的书籍《Cancer Immunoprevention: Methods and Protocols》（*Methods in Molecular Biology*系列，卷2435），2022年出版。
主题与背景
本文聚焦杂交瘤技术（hybridoma technology）的优化与标准化流程，旨在为科研人员提供一套可重复、高效的mAbs生成方案。1975年，Cesar Milstein和Georges Köhler发明的杂交瘤技术通过融合B细胞与骨髓瘤细胞，实现了单一抗体克隆的无限生产，推动了抗体药物（如抗癌药物Rituximab、Trastuzumab）的临床应用。尽管近年涌现了噬菌体展示（phage display）、单B细胞克隆等新技术，杂交瘤技术仍是mAbs的主要来源，因其跨越物种屏障的能力和天然免疫细胞功能的保留。
核心内容与论据
1. 杂交瘤技术的优势与适用性
- 论据：
- 杂交瘤技术可生成高特异性、高亲和力的mAbs，适用于治疗（如抗癌、自身免疫病）、诊断（如ELISA、流式细胞术）及基础研究（如蛋白定位）。
- 对比其他技术（如噬菌体展示），杂交瘤技术无需复杂设备，适合中小型实验室。
- 文中列举了实验室10年内成功生成350余种抗体的案例，印证其可靠性。
2. 关键实验流程的标准化
- 免疫原设计：
- 抗原类型包括肽段-KLH偶联物（keyhole limpet hemocyanin，钥孔戚血蓝蛋白）、重组蛋白、过表达目标蛋白的细胞（如L细胞）或全肿瘤细胞。
- 免疫策略：根据应用目标（如治疗性抗体需靶向特定表位），设计定制化免疫方案。例如，针对细胞表面蛋白的抗体需使用完整细胞免疫。
- 动物免疫与杂交瘤生成：
- 动物模型：常用BALB/c小鼠，若目标蛋白与小鼠同源性强，则选用NZBWF1/J小鼠或基因敲除（KO）小鼠。
- 免疫程序：详细描述足垫（foot-pad）和皮下（subcutaneous）注射的剂量、时间表（如5次基础免疫+3次加强免疫），并通过血清滴定监测免疫反应。
- 细胞融合：使用PEG 1450（聚乙二醇）融合脾细胞或淋巴结B细胞与SP2/0骨髓瘤细胞，HAT（hypoxanthine-aminopterin-thymidine）培养基筛选杂交瘤。
3. 高通量筛选与自动化技术的整合
- 论据：
- 传统筛选：通过ELISA（酶联免疫吸附试验）检测抗体结合活性，包括肽段/蛋白包被ELISA和细胞-ELISA（cell-ELISA）。
- 自动化技术：引入ClonePix 2机器人（Molecular Devices），通过荧光标记抗体自动挑选阳性杂交瘤克隆，提升通量（对比手动筛选效率提高5倍）。
- 文中强调，自动化设备非必需，小型实验室可通过单克隆挑取（single-colony pickup, SCP）技术实现同等质量。
4. 抗体功能验证与临床应用潜力
- 论据：
- 功能验证：包括免疫组化（IHC）、Western blot（WB）、流式细胞术（FACS）及阻断/激动活性测试。例如，抗OX40抗体通过阻断调节性T细胞（Treg）功能增强效应T细胞活性（Voo et al., 2013）。
- 治疗应用：列举抗IL-1β抗体（Canakinumab）通过抑制炎症通路预防肺癌的临床试验（NCT04789681），证实mAbs在癌症免疫预防（cancer immunoprevention）中的价值。
意义与价值
- 方法论贡献：提供了一套从抗原设计到抗体纯化的标准化流程，尤其适合资源有限的实验室。
- 临床转化：文中案例（如抗MFAP5抗体增强卵巢癌化疗敏感性，Yeung et al., 2019）凸显mAbs在治疗中的潜力。
- 技术普适性：流程可适配不同物种（大鼠、兔）和抗原类型（肽段、细胞表面蛋白），扩展了应用场景。
亮点
- 操作细节：如足垫注射的细胞悬液制备、RSCM（rat supplement conditioned media）自制方法等，均为实验室经验总结。
- 灵活性与严谨性：既保留传统步骤（如手动SCP），又引入高通量技术，平衡成本与效率。
- 跨学科应用：涵盖基础研究（如免疫检查点分子表征）到临床治疗（如CAR-T细胞疗法中的scFv片段设计）。
本文不仅是一份技术手册，更通过案例论证了杂交瘤技术在抗体开发中的不可替代性，为癌症免疫治疗等领域提供了实用工具。