本研究由Lirui Sun、Hong Lin、Zhenxing Li（通讯作者）、Weihong Sun、Jianhua Wang、Haiyan Wu、Minmin Ge、Ishfaq Ahmed和Tushar Ramesh Pavase共同完成，分别来自中国海洋大学食品科学与工程学院、中国水产科学研究院黄海水产研究所和山东出入境检验检疫局技术中心。研究成果发表于《Food Chemistry》期刊2019年第276卷，于2018年10月3日在线发表。
学术背景
研究聚焦食品过敏原检测领域，针对鱼类主要过敏原小清蛋白（parvalbumin, PV）的定量分析难题。鱼类过敏是食品安全领域的重要问题，β型小清蛋白（β-PV）因其热稳定性和胰蛋白酶抗性成为检测难点。现有ELISA（酶联免疫吸附试验）和RT-qPCR（实时定量聚合酶链反应）方法存在交叉反应、假阴性等问题。因此，作者旨在开发一种基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）与多反应监测（MRM）技术的高灵敏度定量方法，以满足欧盟等法规对过敏原标识的严格要求（如EU No 1169/2011规定鱼类过敏原需强制标识）。
研究流程
肽段筛选与优化
- 对象：从牙鲆（Paralichthys olivaceus）β-PV的UniProt数据库序列中，通过Skyline软件预测候选肽段，结合体外重组蛋白消化验证，最终选定ALTDAETK、SDFIEEDELK和LFLQNFSASAR三条特征肽段。
- 创新点：通过质谱验证肽段特异性，其中SDFIEEDELK为牙鲆独有序列，其他肽段可跨物种检测。
样品前处理优化
- 提取：采用含DTT（二硫苏糖醇）的Tris-甘氨酸缓冲液提取肌肉蛋白，90℃加热3分钟去除杂质。
- 酶解：使用0.1% Rapigest SF（酸不稳定表面活性剂）辅助变性，优化胰蛋白酶底物比为1:10，10小时消化时间，显著提升埋藏结构肽段（如SDFIEEDELK）的酶解效率。
LC-MS/MS方法开发
- 色谱条件：Waters BEH C18柱（100mm×2.1mm, 2.4μm），0.1%甲酸水/乙腈梯度洗脱，流速0.3 mL/min。
- 质谱参数：Qtrap 5500系统，正离子MRM模式，优化碰撞能（CE）和去簇电压（DP）。针对复杂基质干扰，尝试MRM³（多反应监测立方）技术，但信号强度不足，最终采用常规MRM。
方法验证
- 线性与灵敏度：ALTDAETK的定量范围0.10–1179.36 nM（R²>0.999），检测限（LOD）0.03 μg/g，定量限（LOQ）0.10 μg/g。
- 精密度与准确度：加标回收实验显示日内/日间RSD<18.35%，与BCA法定量结果偏差<13.3%。
主要结果
- 肽段性能差异：ALTDAETK因高灵敏度被选为定量标志物，而SDFIEEDELK因酶解效率低仅用于定性。
- 基质适用性：方法成功应用于猪肉、虾、鸡肉等复杂基质中β-PV检测，加标回收率稳定（RSD<10%）。
- 跨物种检测：在褐石斑鱼、小黄鱼等鱼类中均检出ALTDAETK，证实方法普适性。
结论与价值
本研究建立了首个基于LC-MRM-MS/MS的β-PV定量方法，其创新性体现在：
- 技术层面：通过加热纯化和酶解优化攻克了β-PV的检测难点。
- 法规意义：满足欧盟27.3 mg鱼类蛋白的参考剂量（10%过敏人群反应阈值）的检测需求。
- 应用前景：为食品加工中过敏原残留监控及风险评估提供可靠工具。
研究亮点
- 方法学创新：首次将MRM技术系统性应用于鱼类过敏原定量，并通过ICH Q2（R1）全参数验证。
- 跨学科价值：结合生物信息学（Skyline预测）与质谱技术，为其他过敏原检测提供范式。
- 实际应用性：在复杂食品基质中的成功验证凸显其工业化潜力。
其他价值
研究还提出了未来方向：需进一步优化复杂基质（如深加工食品）中的前处理方法，并联合体内模型评估过敏原性。