本研究于2018年发表在期刊 Analytica Chimica Acta 上，题为“Non-SELEX isolation of DNA aptamers for the homogeneous-phase fluorescence anisotropy sensing of tau proteins”。该研究的主要作者为来自法国格勒诺布尔阿尔卑斯大学、意大利佛罗伦萨大学以及法国多个研究机构的Samuele Lisi、Emmanuelle Fiore、Simona Scarano等学者。通讯作者为Eric Peyrin和Corinne Ravelet。这项工作旨在开发一种针对阿尔茨海默病重要生物标志物——tau蛋白的新型生物传感器，其核心是快速筛选高亲和力的脱氧核糖核酸（DNA）适配体并构建均相检测平台。
研究的学术背景聚焦于阿尔茨海默病的早期诊断生物标志物检测领域。目前，临床上主要依赖于对脑脊液中β-淀粉样蛋白肽和tau蛋白的免疫学检测。然而，以抗体为基础的免疫分析方法存在成本高、标准化困难以及可能存在干扰等缺点。因此，开发替代性的生物仿生识别元件，如核酸适配体，成为一个重要的研究方向。核酸适配体是通过体外筛选技术得到的单链DNA或RNA分子，能够高特异性、高亲和力地结合靶标分子，具有稳定性好、易于合成和修饰等优势。尽管已有一些针对β-淀粉样蛋白的适配体被报道，但针对完整tau蛋白，特别是其多种亚型的高性能DNA适配体却非常缺乏。在此之前，仅有一例针对最长tau亚型（T-441）的RNA适配体被报道，但其分析应用潜力尚未验证，且RNA适配体在生物稳定性和合成成本上不如DNA适配体有优势。此外，已有报道的基于表面等离子体共振（SPR）的tau蛋白检测方法所使用的单链DNA并非通过系统筛选得到的适配体，亲和力有限，且异相检测技术本身存在操作复杂、可能受表面化学干扰等问题。因此，本研究的目标是：第一，利用一种快速的非指数富集配体系统进化技术（Non-SELEX）筛选出针对完整tau蛋白（T-441）的高亲和力DNA适配体；第二，评估筛选出的适配体对多种tau蛋白亚型的识别能力；第三，基于性能最佳的适配体，构建一种操作简便、快速的均相荧光各向异性（FA）传感平台，用于tau蛋白的检测。
本研究的工作流程可分为四个主要部分：适配体的快速筛选与富集、候选序列的鉴定与初步评估、最佳适配体的结合特性表征，以及FA传感平台的构建与分析。
首先，在适配体筛选阶段，研究团队采用了基于毛细管电泳（CE）分选的Non-SELEX策略。与传统指数富集配体系统进化技术（SELEX）每轮筛选后都需要进行聚合酶链式反应（PCR）扩增不同，Non-SELEX在连续多轮筛选中不进行中间扩增，仅在最后进行一次性扩增，这极大地加快了筛选速度并减少了副产物序列的出现。具体流程如下：1. 文库与靶标孵育：将一个包含5 × 10^12条不同序列、荧光标记的随机单链DNA文库（30个随机核苷酸）与靶标tau蛋白（T-441）在结合缓冲液中混合孵育，达到结合平衡。2. 毛细管电泳分选：将平衡混合物注入充满运行缓冲液的毛细管，施加电场。由于蛋白-适配体复合物、游离蛋白和游离DNA的电泳迁移率不同，它们会在毛细管中分离。高亲和力的DNA序列（与蛋白结合）会与低亲和力或非结合序列分离开。3. 收集与迭代：在复合物开始洗脱但大量游离DNA尚未洗脱的时间窗口内，收集流出液。此收集物即为一轮筛选后富集的潜在适配体池。随后，立即将此收集物与新鲜的靶标蛋白混合，进行下一轮孵育和电泳分选，而无需PCR扩增。本研究共进行了三轮筛选，且每轮使用的靶标蛋白浓度依次递减（从7.5 μM降至75 nM），以逐步提高筛选压力，富集最高亲和力的序列。整个筛选过程仅在一个工作日内完成。4. 进程监测：使用非平衡毛细管电泳法（NECEEM）监测筛选进程。通过分析每轮筛选后DNA池与靶标蛋白相互作用的电泳图谱，计算整体解离常数（Kd）。结果显示，经过三轮筛选，DNA池的整体亲和力提升了约60倍（Kd从 >2.5 μM降至约41 nM），证明筛选成功富集了高结合力的序列。
其次，在候选序列鉴定与初步评估阶段，研究团队对第三轮筛选后的DNA池进行了高通量测序（使用Ion Torrent PGM平台）。从获得的2255条不同序列中，根据核苷酸组成偏好性分成了5个组，并从每组中挑选了一条代表性序列（共5条），进行后续研究。为了快速评估这5条候选DNA序列的结合能力，研究者采用了表面等离子体共振技术。将tau蛋白（T-441）共价固定在CM5传感芯片表面，然后分别注射1 μM浓度的各候选适配体，实时监测结合信号。结果显示，名为“3146”的适配体产生的SPR响应信号显著高于其他四条序列，表明其结合能力最强。因此，选择适配体3146进行后续的深入分析和传感平台构建。
第三，对最佳适配体（3146）的结合特性进行详细表征。研究者设计并实施了均相荧光各向异性实验。他们将适配体3146的5’端标记上荧光素（FAM）作为FA探针。FA信号的原理是：当小分子荧光探针（游离适配体）与大的靶标分子（tau蛋白）结合形成复合物后，其分子旋转弛豫时间变慢，导致测得的荧光各向异性值升高。通过测定不同浓度靶标存在下的FA值变化，可以绘制结合曲线并计算解离常数。本实验不仅测试了完整的T-441蛋白，还测试了三种其他的tau蛋白亚型：T-381、T-352和T-383，以评估适配体的交叉反应性。同时，还测试了非相关蛋白人血清白蛋白以及tau蛋白中的一个R3肽段作为对照，以验证检测的特异性。
第四，构建并分析FA传感平台的性能。基于上述FA实验获得的数据，研究者使用希尔结合模型对结合曲线进行拟合，精确计算了适配体3146与四种tau蛋白亚型的微观解离常数（Kd）。此外，根据滴定曲线线性部分的斜率和空白对照的标准偏差，按照3σ准则计算了该方法对各种tau蛋白亚型的检测限。
本研究取得了一系列重要的结果。在筛选阶段，NECEEM监测电泳图直观显示，随着筛选轮次增加，代表复合物的峰高增加，而游离DNA峰高降低，并出现了明显的“衰减桥”，这是复合物在电泳过程中发生解离的特征，也从侧面印证了相互作用的动态性。计算得到的整体Kd值从初始文库的>2500 nM急剧下降至第三轮的约41 nM，确证了Non-SELEX方法在极短时间内高效富集高亲和力序列的有效性。高通量测序结果显示，筛选后的序列库仍然具有很高的多样性（平均Levenshtein距离为21），未形成明显的保守基序簇，这被认为是Non-SLEEX避免PCR偏好性扩增所带来的一种优势，但也增加了挑选代表序列的复杂性。
在SPR初步筛选中，适配体3146的显著高响应（见图3）使其脱颖而出，这一结果直接决定了后续所有深入研究和传感平台构建都围绕此适配体展开。这是整个研究从“筛选”转向“应用验证”的关键节点。
最核心的结果来自于FA结合实验。数据表明：1. 高亲和力与特异性：适配体3146与T-441的结合最强，Kd值为13 ± 3 nM，属于低纳摩尔级别，其亲和力优于此前报道的大多数通过CE-SELEX筛选的蛋白/肽段适配体。与T-383、T-352和T-381的结合也较好，Kd值分别为49 ± 4 nM、84 ± 6 nM和116 ± 6 nM。这表明适配体3146能够识别多种tau蛋白亚型，具有较广的识别谱。2. 结合机制差异：希尔系数分析揭示了一个有趣的现象：适配体与T-441的结合表现为正协同性（nH ≈ 1.86），而与另外三种亚型的结合则表现为非协同性（nH ≈ 1）。这可能暗示适配体与全长T-441的结合位点或结合模式与较短的亚型存在差异。3. 高特异性：在相同实验条件下，人血清白蛋白和R3肽段均未引起FA信号的显著变化，证明该检测平台对tau蛋白具有高特异性。4. 灵敏的检测性能：基于适配体3146的FA传感平台对四种tau亚型的检测限分别为：T-381（3.2 nM）、T-352（6.3 nM）、T-383（22 nM）和T-441（28 nM）。其中对T-381和T-352的检测灵敏度与已报道的针对其他蛋白靶标的FA适配体传感器相当。
本研究的结论是：成功开发了一种快速的Non-SELEX策略，在一天内筛选出针对阿尔茨海默病生物标志物tau蛋白的高亲和力DNA适配体。其中，适配体3146对完整的T-441蛋白具有低纳摩尔级的亲和力，并能交叉识别T-381、T-352和T-383等多种亚型。基于该适配体构建的均相荧光各向异性传感平台，操作简单、快速，能够实现对多种tau蛋白亚型的特异性检测，且具有纳摩尔级的灵敏度。这项研究为tau蛋白的检测提供了一种有潜力的非抗体替代工具，也为针对复杂蛋白靶标的快速适配体筛选提供了成功范例。
本研究的亮点和价值体现在多个方面：首先，在方法学上具有显著新颖性。这是首次将Non-SELEX技术应用于针对全长tau蛋白的DNA适配体筛选，并将整个筛选周期压缩至一个工作日，极大地提升了筛选效率。这证明了Non-SELEX在快速获得高性能适配体方面的实用价值。其次，在研究目标上具有明确的临床相关性。直接针对阿尔茨海默病的关键生物标志物tau蛋白及其多种病理相关亚型开发生物传感元件，紧扣疾病诊断的需求。第三，构建的传感平台优势突出。所开发的均相荧光各向异性检测方法无需固相载体和分离步骤，减少了非特异性吸附的干扰，操作简便快速，为未来开发即时检测设备奠定了基础。第四，获得了性能优异的识别元件。适配体3146展现出的高亲和力、广谱识别性（对多种亚型）和高特异性，使其成为未来构建tau蛋白检测试剂盒或集成传感器的理想核心元件。尽管目前达到的检测限（纳摩尔级）距离检测脑脊液中皮摩尔级别的生理/病理浓度还有差距，但这项工作为后续通过信号放大策略（如使用纳米材料、杂交链式反应等）进一步提高灵敏度铺平了道路。该研究在适配体筛选方法、识别元件开发以及生物传感平台设计三个层面均做出了有价值的贡献。