本研究由南京中医药大学中西医结合学院的韩暄（Xuan Han）与江苏省中西医结合医院的杨永兵（Yongbing Yang）作为共同第一作者完成，通讯作者为韩暄、陈静（Jing Chen）及曹鹏（Peng Cao）。研究团队来自南京中医药大学、蚌埠医科大学等多个研究机构。该论文发表于《Acta Pharmaceutica Sinica B》2026年第16卷第6期，第3934至3952页。
三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是乳腺癌中侵袭性最强的亚型，约占所有新诊断乳腺癌病例的10%—15%。与其他乳腺癌亚型相比，TNBC患者预后较差，诊断后5年内死亡率高达40%，1—3年内复发率较高。此外，约33%的TNBC患者会发生远处转移，中位总生存期仅为13—18个月。由于缺乏明确的生物标志物，TNBC的靶向治疗仍处于探索阶段。
以铂类药物为基础的化疗在TNBC治疗中仅能取得短期疗效，其原因在于化疗后肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中出现了免疫抑制性巨噬细胞的富集。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）在TME中占免疫细胞总数的10%—20%，在不同刺激下可分化为M1型（促炎、抗肿瘤）或M2型（抗炎、促肿瘤）表型。化疗后TNBC肿瘤中M2型TAMs增多而CD8+ T细胞减少，这一“M2高/CD8低”的特征与患者预后不良密切相关。
已有研究发现，Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）激动剂可诱导巨噬细胞向M1型极化，但传统TLR激动剂存在生物相容性不足的问题。植物来源的外泌体样纳米颗粒（plant-derived nanoparticles，PDNPs）在植物免疫防御中发挥重要作用，但其在癌症免疫治疗中的跨物种应用仍鲜有报道。黄芪（Astragalus membranaceus）在亚洲被用于临床治疗和食品补充已有数千年历史，其活性成分黄芪甲苷IV和黄芪多糖均显示出免疫调节作用。然而，黄芪来源的外泌体样纳米颗粒（astragalus-derived exosome-like nanoparticles，ADNPs）在肿瘤免疫中的作用尚未明确。
本研究旨在探索ADNPs联合顺铂（cisplatin，Cis）化疗对TNBC的治疗效果，并阐明其通过TLR2信号通路重塑TAMs的分子机制。
研究团队从新鲜黄芪根中通过榨汁、过滤和差速离心等一系列步骤分离纯化ADNPs。具体流程为：将新鲜黄芪茎用慢速榨汁机研磨提取汁液，随后依次在2000×g和10000×g条件下离心去除大块碎片和纤维物质，再将上清液在100000×g条件下超速离心60分钟。沉淀重悬于PBS后，铺于8%、15%、30%、45%和60%的蔗糖梯度上进行第二次超速离心，最终收集15%蔗糖层中的囊泡组分。纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）显示ADNPs的粒径分布在200—300 nm之间，透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）观察证实其为双层椭圆形纳米囊泡，平均表面电位为−24.741 mV。脂质组学和代谢组学分析显示ADNPs主要含有鞘磷脂（约80%）和神经酰胺（约4%），并含有黄芪的两种代表性活性成分——芒柄花素（formononetin）和芒柄花苷（ononin）。
研究团队使用Dii或DiO荧光染料标记ADNPs，通过流式细胞术和共聚焦显微镜分析了不同细胞对ADNPs的吞噬效率。在4T1和EO771乳腺癌细胞中，ADNPs的摄取率极低（48小时后不足1.1%）。而在骨髓来源的巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages，BMDMs）中，暴露36小时后约27.5%的细胞摄取了ADNPs，且吞噬活性随时间逐渐增加。使用巨胞饮抑制剂EIPA处理后ADNPs的吞噬显著受抑，而吞噬抑制剂Filipin III和Nocodazole无显著影响，提示巨噬细胞主要通过巨胞饮途径摄取ADNPs。体内生物分布实验显示，ADNPs可稳定存在于小鼠的脾脏、肝脏、肺和肿瘤组织中。
研究建立了三种TNBC小鼠模型（4T1、EO771和PY8119），将5×10⁵个肿瘤细胞接种于6周龄雌性小鼠的第四乳腺脂肪垫下。当肿瘤体积达到50—100 mm³时开始治疗，小鼠分为四组：生理盐水对照组、ADNPs单独治疗组（200 μg/100 μL/只，腹腔注射）、顺铂单独治疗组（68 μg/100 μL/只，腹腔注射）和ADNPs联合顺铂治疗组（ADNP-Cis）。治疗于第8、11、14、17和20天进行，每两天测量一次肿瘤体积。此外，还建立了4T1乳腺癌肺转移模型和肝转移模型，以及TLR2基因敲除（TLR2−/−）小鼠模型以验证TLR2通路的作用。通过氯膦酸盐脂质体（clodronate liposomes，CL）清除巨噬细胞的实验用于验证ADNPs的作用是否依赖于巨噬细胞。
肿瘤组织经胶原酶IV和DNase消化后制备单细胞悬液，通过Percoll密度梯度离心分离免疫细胞。使用多种荧光标记抗体进行流式细胞术分析，包括CD45、CD3、CD4、CD8、CD86、CD206、F4/80、PD-1、Tim3、IFN-γ、颗粒酶B（granzyme B）、TNF-α和Ki67等标记。免疫组化和免疫荧光染色用于检测肿瘤组织中CD8和CD163的表达及定位。单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据来自公开数据库（GSE176078和GSE58812）。
通过RNA测序（RNA-seq）分析ADNPs处理后的M2型BMDMs基因表达变化，KEGG通路富集分析显示TLR信号通路显著激活。分子对接（molecular docking）模拟了芒柄花素与TLR2的结合模式，结合能约为−8 kcal/mol。分子动力学模拟（molecular dynamics simulation）进一步验证了TLR2-芒柄花素复合物在20 ns后达到稳定构象。Pull-down实验结合质谱分析鉴定了芒柄花素的直接结合蛋白。
通过对TNBC患者scRNA-seq数据的分析，研究者发现化疗后肿瘤中M2型TAMs显著增多，而CD8+ T细胞、CD4+ T细胞和浆母细胞等细胞毒性免疫细胞显著减少。TCGA数据库分析显示，CD163高/CD8A低表达的患者生存期显著短于CD163低/CD8A高表达的患者（p=0.016）。免疫组化分析进一步证实了CD163和CD8表达在TNBC肿瘤样本中呈负相关。在4T1小鼠模型中，紫杉醇和顺铂治疗均导致M2/M1巨噬细胞比例升高和CD8+ T/CD45+细胞比例降低，与scRNA-seq结果一致。
在4T1、EO771和PY8119三种TNBC小鼠模型中，ADNP-Cis联合治疗组的肿瘤体积和肿瘤重量均显著低于顺铂单独治疗组和ADNPs单独治疗组。ADNP-Cis治疗还显著延长了小鼠的生存时间。组织学分析显示ADNP-Cis治疗组肿瘤细胞有丝分裂显著减少，Ki67蛋白表达显著降低。
与顺铂单独治疗组相比，ADNPs和ADNP-Cis治疗显著逆转了顺铂引起的红细胞计数、血小板计数和血红蛋白水平的降低。ADNPs还能恢复顺铂抑制的促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）水平，并降低顺铂升高的丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平。集落形成实验显示ADNPs能有效保护骨髓干细胞的克隆形成能力。
流式细胞术分析显示，ADNP-Cis治疗组肿瘤组织中CD45+免疫细胞浸润显著增加。ADNPs单独或联合顺铂治疗显著增加了M1型TAMs比例，降低了M2型TAMs比例，M1/M2比值显著升高。ADNP-Cis治疗还显著增加了CD3+ T细胞和CD8+ T细胞的浸润，提高了CD8+/Treg比值。ADNPs治疗显著降低了CD8+ T细胞表面PD-1的表达，以及CD4+ T细胞表面Tim3和PD-1的表达，表明T细胞耗竭得到缓解。
ADNPs显著增加了肿瘤内CD8+ T细胞中IFN-γ、颗粒酶B和TNF-α的表达水平，并提高了Ki67+增殖性CD8+ T细胞的比例（较顺铂组增加16%）。CD4+ T细胞中IFN-γ、颗粒酶B和TNF-α的表达同样显著升高。在脾细胞中，ADNP-Cis治疗组小鼠在肿瘤切除63天后仍保持更高比例的中央记忆T细胞和效应记忆T细胞，表明ADNP-Cis治疗能诱导持久的抗肿瘤免疫记忆。
RNA-seq分析显示ADNPs处理后的M2型BMDMs中TLR信号通路显著激活，其中TLR2表达显著上调。ADNPs处理还显著增加了TLR2通路下游蛋白p-IKKβ、p-p65、p-p50和IκBα的表达。免疫荧光共定位分析显示Dii标记的ADNPs与TLR2的Pearson相关系数约为0.87。在TLR2−/−小鼠中，ADNPs的抗肿瘤效果显著减弱，证实了TLR2在ADNPs介导的免疫调节中的关键作用。体外实验表明，芒柄花素（而非芒柄花苷）能有效促进M2型BMDMs向M1型极化。分子对接和Pull-down实验证实芒柄花素能与TLR2直接结合。
本研究首次证明了ADNPs作为一种天然TLR2激动剂，能够高效地将M2型TAMs重编程为M1型，增强CD8+ T细胞的浸润和细胞毒性功能，从而显著增强顺铂化疗对TNBC的治疗效果。ADNP-Cis联合治疗在三种TNBC小鼠模型中均表现出显著的肿瘤抑制作用，并能有效抑制肺转移和肝转移。更重要的是，ADNPs能显著减轻顺铂引起的骨髓抑制等血液学毒性，且毒副作用远低于此前报道的其他TLR2激动剂。
本研究的科学价值在于揭示了植物来源纳米颗粒在哺乳动物免疫调节中的跨物种应用潜力，提出了“化疗联合TME重塑”的新辅助治疗策略。其应用价值在于为TNBC患者提供了一种高效、低毒、易于制备的联合治疗方案，有望改善铂类化疗的临床结局。此外，ADNPs作为可食用的天然纳米载体，解决了芒柄花素水溶性差、生物利用度低的问题，为中药活性成分的纳米递送提供了新思路。
本研究的创新之处主要体现在：首先，首次证实ADNPs可通过激活TLR2信号通路重塑TAMs，其活性成分为芒柄花素而非芒柄花苷；其次，ADNPs在低浓度下即能发挥免疫调节作用（所需浓度仅为游离芒柄花素的五十分之一），充分体现了纳米结构在药物递送中的优势；再次，ADNP-Cis联合治疗在抑制肿瘤的同时能够缓解化疗引起的骨髓抑制，这一“增效减毒”的双重优势在此前的PDNPs研究中未见报道；最后，ADNPs诱导的持久免疫记忆为预防肿瘤复发和转移提供了可能。