本研究由来自中国天津医科大学总医院老年病科（Department of Geriatrics, Tianjin Medical University General Hospital）、南开大学医学院（School of Medicine, Nankai University）和天津神经科学研究所（Tianjin Neurological Institute）的Conglin Wang、Fangyuan Cheng、Zhaoli Han等学者共同完成，通讯作者为Ping Lei教授。研究成果于2025年2月发表在期刊《Neural Regeneration Research》（第20卷第2期）上，论文标题为《Human-induced pluripotent stem cell–derived neural stem cell exosomes improve blood–brain barrier function after intracerebral hemorrhage by activating astrocytes via PI3K/Akt/MCP-1 axis》。
学术背景
该研究聚焦于脑出血（intracerebral hemorrhage, ICH）后继发性损伤的治疗难题。脑出血后血脑屏障（blood–brain barrier, BBB）破坏导致的脑水肿是神经功能恶化的关键因素。尽管神经干细胞（neural stem cells, NSCs）在神经修复中具有潜力，但其直接移植存在伦理和技术障碍。人诱导多能干细胞来源的神经干细胞外泌体（human-induced pluripotent stem cell–derived neural stem cell exosomes, hiPSC–NSC–Exos）因其低免疫原性和高生物相容性成为潜在替代方案，但其在ICH中的作用机制尚不明确。本研究旨在探索hiPSC–NSC–Exos对BBB的保护作用及其分子机制。
研究流程与方法
hiPSC–NSC–Exos的制备与鉴定
- 细胞分化：将hiPSCs（人诱导多能干细胞）诱导分化为NSCs，通过免疫荧光检测NSC标志物（Nestin、Sox-1、Sox-2、Pax-6）确认分化成功。
- 外泌体提取：采用超速离心法从第三代NSCs培养液中分离外泌体，通过透射电镜观察其形态（直径50-130 nm的圆形或椭圆形囊泡），纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）测定粒径分布（125.1 ± 39.3 nm），并通过Western blot检测外泌体标志蛋白（CD9、CD63、Alix）。
动物模型建立与干预
- ICH模型：184只雄性C57BL/6J小鼠通过立体定位注射细菌胶原酶IV诱导右侧基底节区ICH。
- 干预方案：小鼠随机分为PBS对照组和hiPSC–NSC–Exos治疗组（5 μg/g，鼻内给药，连续3天）。通过DIR荧光标记和PKH26染色证实外泌体可靶向聚集于脑出血病灶，并被内皮细胞和星形胶质细胞摄取。
神经功能与BBB评估
- 行为学测试：通过转棒实验（rotarod test）、转角实验（corner turn test）和改良神经功能缺损评分（modified neurological severity score, mNSS）评估运动协调能力。结果显示，Exos组小鼠神经功能显著改善（p < 0.05）。
- BBB完整性检测：伊文思蓝（Evans blue, EB）渗透实验显示Exos组EB泄漏减少（p < 0.001）；Western blot和免疫荧光显示紧密连接蛋白（ZO-1、Claudin-5）表达上调。
炎症微环境分析
- 流式细胞术：Exos组脑组织中中性粒细胞（CD45highCD11b+Ly6G+）、巨噬细胞（CD45highCD11b+F4/80+）等免疫细胞浸润显著减少（p < 0.01），但脾脏中无差异，提示Exos特异性抑制脑内炎症。
- Luminex液相芯片：Exos组病灶区单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1）表达显著降低（p < 0.001）。
机制探究
- RNA测序与通路分析：发现PI3K/Akt信号通路显著激活。Western blot证实Exos组p-PI3K和p-Akt表达上调。
- 抑制剂验证：使用PI3K/Akt抑制剂LY294002可逆转Exos的神经保护作用，加重脑水肿（p < 0.01）。
- 体外BBB模型：共培养内皮细胞（bEnd.3）和星形胶质细胞（C8-D1A），证实Exos通过激活星形胶质细胞PI3K/Akt通路抑制MCP-1分泌，从而减少内皮细胞渗漏（p < 0.001）。
主要结果与逻辑关系
- 结果1：hiPSC–NSC–Exos改善ICH后神经功能缺损，其机制与BBB完整性增强相关（ZO-1、Claudin-5上调）。
- 结果2：Exos减少脑内免疫细胞浸润及MCP-1分泌，提示其通过调节炎症微环境发挥作用。
- 结果3：RNA测序和抑制剂实验证实PI3K/Akt/MCP-1轴是Exos保护BBB的核心通路。体外实验进一步验证星形胶质细胞是该通路的关键靶细胞。
结论与价值
本研究首次阐明hiPSC–NSC–Exos通过激活星形胶质细胞PI3K/Akt通路、抑制MCP-1分泌，从而减轻ICH后BBB破坏和神经炎症。其科学价值在于：
1. 机制创新：揭示了外泌体调控星形胶质细胞表型转换（A1促炎型向A2抗炎型转化）的新机制。
2. 治疗潜力：为ICH提供了无细胞、低免疫原性的治疗策略，克服了干细胞移植的伦理和安全问题。
3. 技术应用：鼻内给药方式具有临床转化可行性，外泌体规模化制备技术为其他神经系统疾病研究提供参考。
研究亮点
- 多模态验证：结合体内外模型、RNA测序和特异性抑制剂，系统解析了Exos的作用通路。
- 转化医学意义：hiPSC–NSC–Exos可发展为个性化治疗工具，避免异体移植排斥风险。
- 创新方法：建立的体外BBB共培养模型为药物筛选提供了标准化平台。
其他价值
研究局限性包括未解析外泌体的具体活性成分，以及未探讨周细胞在BBB保护中的作用。未来可通过蛋白质组学进一步优化外泌体制剂，并构建包含周细胞的三维BBB模型以完善机制研究。