抑制CAF-1组蛋白伴侣复合物触发胞质DNA和dsRNA感知通路并诱导肝细胞癌的内在免疫

本研究由来自香港大学李嘉诚医学院病理学系及肝病研究国家重点实验室的For-Fan Chan、Vincent Wai-Hin Yuen、Jialing Shen、Don Wai-Ching Chin、Cheuk-Ting Law、Bowie Po-Yee Wong、Cerise Yuen-Ki Chan、Jacinth Wing-Sum Cheu、Irene Oi-Lin Ng、Carmen Chak-Lui Wong及Chun-Ming Wong等人完成，通讯作者为Chun-Ming Wong。该研究发表于Hepatology，由美国肝病研究学会（AASLD）于2023年在线发表。研究得到了香港一般研究基金、研资局主题研究计划及协作研究基金等多项资助。

在学术背景方面，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是肝癌中最常见的类型，2020年在全球癌症发病率中位列第六，在癌症相关死亡原因中高居第三。尽管免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）已获美国食品药品监督管理局批准用于多种癌症的治疗，但在HCC患者中仅有一小部分能够从中获益，晚期HCC常因多种免疫逃逸机制而对ICIs治疗无效。近年来的研究表明，表观遗传干预如DNA甲基转移酶（DNMT）或赖氨酸特异性去甲基化酶1（LSD1）抑制剂，可激活抗肿瘤免疫反应并提高肿瘤对ICI治疗的敏感性。然而，组蛋白伴侣及组蛋白变体如何参与HCC免疫应答仍不清楚。组蛋白伴侣染色质组装因子1（chromatin assembly factor 1，CAF-1）由CHAF1A、CHAF1B和RBBP4三个亚基组成，在DNA复制期间将经典组蛋白H3.1组装到染色质中。CAF-1介导的H3.1掺入对复制期间异染色质的建立至关重要；而HIRA和ATRX/DAXX复合物则以复制非依赖性方式将H3.3掺入转录活跃位点和调控区域。内源性逆转录病毒（endogenous retroviruses，ERVs）约占人类基因组的8%–9%，在异染色质中通常被沉默，其转录激活可导致基因组不稳定并削弱细胞适应性。当表观遗传状态受损时，ERVs被去抑制并转录形成双链RNA（dsRNA），即所谓的“病毒模拟”（viral mimicry），被模式识别受体识别，进而通过MAVS和TRIF等信号适配器激活NF-κB和IRF等转录因子，增强炎症因子的表达。此外，胞质中的双链DNA及染色质也可通过STING适配器介导模式识别受体通路。微核（micronuclei）是胞质DNA泄漏的主要来源之一，其核膜完整性差且易破裂，释放DNA至胞质并激活胞质DNA感知通路及免疫反应。本研究旨在探讨CAF-1复合物在HCC中的免疫调节作用及其治疗潜力。

在研究方法与工作流程方面，研究首先分析了HCC患者队列及癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）队列中组蛋白伴侣的表达谱，并通过免疫组织化学染色验证CAF-1复合物亚基在人类HCC组织中的上调情况。利用ROC曲线分析评估CAF-1作为HCC检测生物标志物的潜力；同时分析CAF-1表达与增殖标志物Ki67、多能性基因、肿瘤分级、缺氧评分及患者生存结局的关系。其次，研究利用CRISPR/Cas9系统在MHCC97L和Huh-7 HCC细胞系中敲除CHAF1B基因，建立CAF-1敲除细胞系，并通过Sanger测序和Western blot验证基因突变及蛋白缺失。通过细胞增殖、克隆形成和Transwell迁移实验评估敲除对HCC细胞增殖与转移能力的影响；利用原位异种移植裸鼠模型检测CAF-1敲除对肝脏肿瘤形成及肺转移的影响；并通过流体动力学尾静脉注射技术在水动力转染免疫健全小鼠中特异性敲除Tp53并过表达c-Myc以诱导自发性HCC，同时敲除CAF-1以观察其对肿瘤发生和小鼠生存期的影响。第三，研究进一步解析CAF-1敲除引起的细胞生物学改变。采用碘化丙啶染色分析细胞周期分布，EdU掺入实验检测DNA合成速率，Western blot检测γH2AX、磷酸化p53及RPA32 pThr21等DNA损伤和复制应激标志物，β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老，并通过RNA测序（RNA-seq）和基因集富集分析（GSEA）评估衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）基因集的表达。第四，为揭示CAF-1对ERVs沉默的调控机制，研究对染色质提取物进行Western blot检测H3.1和H3.3水平，开展染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析H3.1和H3.3在ERVs区域的分布，利用ATAC-seq评估染色质可及性变化，并运用RepEnrich2软件定量重复元件的表达。第五，为验证ERVs双向转录形成dsRNA，研究进行了链特异性RNA-seq、链特异性cDNA PCR、dsRNA特异性抗体J2的点杂交和流式细胞术分析，以及dsRNA提取后的RT-qPCR。第六，研究通过免疫荧光检测微核和dsDNA，通过RT-qPCR和Western blot检测STING、TRIF、cGAS、IRF3/IRF7、NF-κB通路相关分子的表达与活化，并利用siRNA介导STING、MAVS及TRIF敲低以验证这些适配器在免疫基因上调中的作用。第七，在小鼠HCC细胞系Hepa1-6中敲低Chaf1b，利用同系皮下和原位肿瘤模型评估肿瘤生长及T细胞浸润情况，通过流式细胞术分析CD4+、CD8+ T细胞及穿孔素和颗粒酶B的表达，最后在免疫健全小鼠中联合使用抗PD-1抗体评估CAF-1抑制对ICI治疗的增敏效果。

研究的主要结果显示，CAF-1复合物在人类和小鼠HCC中显著上调，且其高表达与患者预后不良相关。敲除CAF-1在体外和体内均显著抑制HCC生长与转移。机制上，CAF-1缺失导致复制应激和染色质不稳定，形成微核并引起胞质DNA泄漏；ChIP-seq显示CAF-1敲除后H3.3组蛋白变体在ERVs区域大量替换H3.1，染色质可及性增加，ERVs表达被激活，形成病毒模拟。胞质微核和ERVs分别被STING和dsRNA病毒感知通路识别，从而激活炎症反应和抗肿瘤免疫监视，并显著增强ICI在HCC中的抗癌效果。具体而言，CAF-1缺失导致细胞周期S期和G2期阻滞、DNA合成速率下降、DNA损伤和复制应激标志物升高，并诱导细胞衰老及SASP基因表达上调。ChIP-seq和ATAC-seq数据显示H3.1在染色质中全面减少，H3.3在ERVs家族如HERV9上显著富集，重复元件的染色质可及性大幅升高，RepEnrich2分析证实HERV9和LTR12等ERV元件表达上调。链特异性RNA-seq和J2抗体实验进一步证明ERVs双向转录并形成胞质dsRNA。免疫荧光显示CAF-1敲除细胞微核和胞质dsDNA增多，STING信号通路被激活，dsRNA感知适配器TRIF及其下游NF-κB和干扰素信号通路显著上调。siRNA敲低STING、MAVS和TRIF可削弱CCL2和IFNβ的上调，说明这些核酸感知通路在CAF-1敲除诱导的免疫应答中发挥关键作用。体内实验中，Chaf1b敲低不仅抑制肿瘤生长，而且显著增加CD4+和CD8+ T细胞浸润及细胞毒性T细胞活性，且与抗PD-1抗体联合治疗可进一步抑制肿瘤生长并增加CD8+ T细胞浸润。

本研究的结论是，CAF-1对HCC的发展至关重要，靶向CAF-1可唤醒抗肿瘤免疫应答，并可与ICI治疗协同发挥作用。该研究揭示了CAF-1组蛋白伴侣复合物通过调控H3.1掺入维持基因组稳定性并抑制ERVs表达，从而在HCC中发挥免疫调节作用。其科学价值在于阐明了组蛋白伴侣和组蛋白变体在肿瘤免疫应答中的新机制，提出了“病毒模拟”和微核介导的核酸感知通路激活在表观遗传治疗中的重要性；其应用价值在于为晚期HCC患者提供了一种潜在的表观遗传联合免疫治疗策略，即通过抑制CAF-1将“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤，从而提高ICI治疗的临床获益。

本研究的亮点包括：首次系统揭示了CAF-1抑制在HCC中同时激活胞质DNA感知和dsRNA感知两条固有免疫通路的双重机制；利用CRISPR/Cas9敲除结合多组学技术（RNA-seq、ChIP-seq、ATAC-seq）深入解析了H3.1到H3.3组蛋白变体转换与ERVs去抑制及染色质可及性的因果关系；并通过免疫健全小鼠模型证明了CAF-1抑制可增强抗PD-1治疗的疗效，为表观遗传靶点与免疫治疗的联合应用提供了直接实验证据。此外，研究还发现CAF-1表达与TP53突变及缺氧评分相关，提示其可能参与HCC的分子分型和预后判断。