这项研究由Hongtao Wen、Hui Liu、Jinfang Liu、Bendong Yang、Jiaxing Dai、Lei Chang、Yanchang Li、Yao Zhang、Liyan Yu和Ping Xu等人完成，通讯作者为中国医学科学院药物生物技术研究所的Liyan Yu和Ping Xu。该论文发表于Analytical Chemistry期刊。

研究背景方面，靶向蛋白降解（TPD）技术中的蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）分子通过劫持泛素-蛋白酶体系统（UPS）实现对疾病相关蛋白的选择性降解，已在临床开发中展现出巨大潜力。然而，PROTAC的“降解型脱靶效应”构成了其临床转化的重要障碍。与传统小分子抑制剂的“结合型脱靶效应”不同，PROTAC以催化方式诱导非预期底物的泛素化与蛋白酶体降解，且此类事件常独立于转录调控或高亲和力结合，使得转录组分析或传统结合实验难以全面捕捉。全蛋白质组学虽广泛用于绘制降解图谱，但其主要反映蛋白丰度变化，无法直接捕获泛素依赖性降解事件。泛素组学（ubiquitinomics）则能提供位点特异性的泛素化信息，可作为降解事件的更早期、更灵敏指标。本研究旨在建立整合全蛋白质组学与深度泛素组学的策略，系统评估经典PROTAC分子dBET1在Jurkat T细胞中的在靶与脱靶降解图谱，并揭示此前被忽略的机制性安全性风险。

在实验流程方面，研究分为五个主要环节。第一环节为dBET1药效动力学验证，在Jurkat细胞中以0.003至10 μM浓度梯度处理45分钟，确定半数降解浓度（DC50）约为0.33 μM；随后在0.33 μM下进行时间梯度实验，发现BRD3降解在40分钟时达到最大降解通量阶段（约33%–46%降解），故选择40分钟为最优处理时间以捕获瞬时泛素化中间体。第二环节为全蛋白质组学分析，在优化条件下处理细胞后，采用Orbitrap Astral质谱仪以数据非依赖采集（DIA）模式进行定量分析，设置两个独立生物学重复、每个生物学样品两个技术重复，最终定量超过5000个蛋白。第三环节为深度泛素组学分析，使用Orbitrap Exploris 480质谱仪结合高场不对称波形离子迁移谱（FAIMS）接口，以数据依赖采集（DDA）模式配合气相分级（补偿电压−45 V和−65 V交替），在75分钟梯度下鉴定并定量超过10000个泛素化位点。第四环节为多组学整合筛选，将蛋白丰度变化与位点特异性泛素化变化进行交叉关联，采用“蛋白丰度显著下降且泛素化显著上升”的严格标准筛选候选直接降解靶标，并以转录组数据排除转录下调所致蛋白减少。第五环节为候选脱靶蛋白的功能验证，通过蛋白质印迹、环己酰亚胺（CHX）追逐实验、免疫沉淀-泛素印迹、siRNA敲低CRBN或VDAC1、JC-1线粒体膜电位染色及Rhod-2 AM线粒体钙离子流式分析等手段验证VDAC1作为dBET1推定脱靶底物的降解机制及其线粒体功能后果。

主要结果方面，全蛋白质组学显示dBET1处理引起有限的全蛋白质组扰动（高斯拟合均值0.06），BRD3、BRD4及BRD2均显著下降；以FC < 0.5且FDR < 0.01为标准，两个独立实验中重复性下调蛋白63个，火山图分析显示94个显著下调蛋白。泛素组学中，BRD3的K99位点泛素化在dBET1处理组中升高超过227倍，BET家族共鉴定12个泛素化肽段，其中11个在对照组中低或不可检测而在dBET1处理后被显著诱导。多组学整合后，18个蛋白（35个位点）同时满足蛋白下调且泛素化上调的标准，其中9个位点映射到BRD3和BRD4，其余16个蛋白（26个位点）为潜在脱靶，包括ASPM、SAT1和VDAC1等。转录组交叉验证显示这18个候选蛋白的mRNA水平均无显著变化，排除转录下调因素。在MV4−11细胞中，仅4个蛋白落入第二象限，其中包括BRD3和BRD4，验证了分析平台的灵敏性。在功能验证中，dBET1以时间和剂量依赖方式降低VDAC1蛋白水平，CHX追逐实验证实其半衰期缩短，免疫沉淀显示VDAC1多泛素化显著累积，siRNA敲低CRBN完全废除dBET1诱导的VDAC1泛素化并恢复其蛋白水平。JC-1染色显示dBET1处理导致线粒体膜电位去极化，Rhod-2 AM流式分析显示线粒体基础钙水平下降且对钙离子载体CAUP刺激的钙积累能力降低约26%，VDAC1 siRNA敲低可表型复制上述线粒体缺陷。

研究结论指出，整合全蛋白质组学与深度泛素组学可显著提高PROTAC安全性评估的灵敏度，能够发现常规全蛋白质组学筛查遗漏的机制性脱靶事件。dBET1除高效降解经典BET家族靶标BRD3和BRD4外，还将线粒体外膜蛋白VDAC1作为推定脱靶底物，通过CRBN依赖性多泛素化触发其蛋白酶体降解，进而导致线粒体膜电位去极化和钙稳态失调。该研究提示CRBN基PROTACs可能通过脱靶VDAC1降解引发线粒体应激，并对临床前安全性评价中纳入线粒体风险评估提出了明确需求。

本研究的亮点在于：第一，首次将全蛋白质组学与深度泛素组学在无标签、无外源报告系统的生理条件下整合，实现了超过5000蛋白和10000泛素化位点的定量覆盖；第二，通过“蛋白下降+泛素化上升”的双重标准识别了18个高置信度候选直接靶标，其中88%的蛋白和74%的位点为此前未报道的脱靶事件；第三，在BRD3中实现了位点分辨率的功能性降解事件解析，发现泛素化优先发生于功能必需的溴结构域，提示富含降解决定子的区域可能决定结构域选择性降解；第四，揭示VDAC1作为dBET1响应性降解候选蛋白，并将其与线粒体去极化和钙稳态破坏功能关联，为PROTAC类药物的线粒体毒性风险提供了机制性证据。此外，Jurkat细胞高CRBN背景作为“压力测试”系统揭示了低亲和力、机制性脱靶，而MV4−11细胞低CRBN背景中脱靶图谱明显收窄，表明E3连接酶的细胞丰度是决定PROTAC脱靶广度的重要变量。