这项研究由意大利国家卫生研究院（Istituto Superiore di Sanità）传染病部门的Marilena P. Etna和Eliana M. Coccia作为共同通讯作者领导，联合了来自意大利萨皮恩扎大学、圣乔瓦尼-罗通多IRCCS-Casa Sollievo della Sofferenza基金会医疗遗传学部、法国巴黎巴斯德研究所INSERM细胞因子信号单元等多个机构的研究人员共同完成。研究成果以题为“Genome-wide gene expression analysis of MTB-infected DC highlights the rapamycin-driven modulation of regulatory cytokines via the mTOR/GSK-3β axis”的原创研究论文形式，于2021年4月16日发表在免疫学领域期刊《Frontiers in Immunology》上。

学术背景 结核病（Tuberculosis, TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）引起的、每年导致数百万人发病的致命性传染病。尽管存在抗生素疗法，但疗程长、副作用大以及耐药菌株的出现等问题促使研究者寻找新的治疗策略。宿主导向疗法（Host-Directed Therapy, HDT）成为一种有前景的思路，旨在通过调节宿主的免疫反应来控制感染。其中，自噬（autophagy）作为细胞的一种清除和循环机制，在抗MTB免疫中扮演关键角色，但MTB已进化出抑制宿主细胞自噬的能力。

雷帕霉素（rapamycin）是一种自噬诱导剂，同时也是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）的抑制剂。研究团队此前的工作已经发现，雷帕霉素能够克服MTB在人类树突状细胞（dendritic cells, DC）中诱导的自噬阻断，并通过促进白细胞介素-12（IL-12）的分泌来驱动保护性的Th1型免疫应答。然而，雷帕霉素在MTB感染的DC中发挥免疫刺激作用的具体分子机制尚不完全清楚。特别是，mTOR作为蛋白质翻译的关键调控因子，其抑制如何影响DC在感染状态下的全局基因表达和蛋白质合成，进而精细调控细胞因子网络，是本研究的核心科学问题。

因此，本研究旨在通过全基因组范围的转录组（transcriptome，反映基因转录水平）和翻译组（translatome，反映活跃翻译的mRNA水平）分析，深入探究雷帕霉素处理对MTB感染的人原代DC的免疫调节功能的影响，并阐明其下游的关键信号通路，以揭示其作为HDT候选药物的分子基础。

详细工作流程 本研究设计严谨，流程复杂，主要包含以下几个核心步骤：

1. 细胞制备与感染模型建立： 研究使用健康献血者的外周血单个核细胞，通过粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素-4（IL-4）培养5天，诱导分化为未成熟的DC（纯度>90% CD1a+）。随后，DC用MTB H37Rv标准菌株以1:1的感染复数（MOI）进行感染。在感染后4小时，对部分感染组细胞加入雷帕霉素（0.2 µM）或另一种mTOR抑制剂Torin1（同时抑制mTORC1和mTORC2）进行处理。设置未感染对照、仅雷帕霉素处理对照、仅MTB感染组以及MTB感染+雷帕霉素处理组。

2. 样本收集与核酸提取： 在感染后特定时间点（如16小时用于组学分析，24小时用于细胞因子检测等）收集细胞。为了进行转录组和翻译组分析，研究采用了特殊的分级分离技术。具体而言，将细胞裂解后，通过蔗糖密度梯度超速离心分离出核糖体及其相关的mRNA。收集梯度顶部的“轻相”（核糖体占有率低，代表翻译不活跃的mRNA）和底部的“重相”（与多聚核糖体结合，代表翻译活跃的mRNA）。分别从总RNA以及“重相”RNA中提取RNA，后者即代表翻译组样本。这种方法能够区分基因表达是在转录水平被调控，还是在翻译效率层面被调控。

3. 微阵列基因表达谱分析： 使用GeneChip Human Transcriptome Array 2.0芯片对上述获得的总RNA样本（转录组）和“重相”RNA样本（翻译组）进行全基因组表达谱分析。每个实验条件（对照、雷帕霉素、MTB、MTB+雷帕霉素）均包含来自4名独立供体的DC样本，确保了结果的可靠性。芯片原始数据通过RMA算法进行归一化和对数转换。差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）的筛选标准为错误发现率（FDR）< 0.01且表达倍数变化（log2FC）绝对值 > 1.5。随后，对筛选出的DEGs进行了基因本体（Gene Ontology, GO）功能富集分析和KEGG/Reactome通路富集分析，以了解受影响的生物学过程和信号通路。

4. 关键结果的验证实验： 鉴于微阵列结果为高通量筛选数据，研究者使用了一系列分子生物学技术对关键发现进行验证。

   • 数字PCR（digital PCR）： 用于绝对定量关键基因（如IFN-β1, IFN-λ1, CXCL9, CXCL11, IFIH1, IFIT3, IRF7）在总RNA和“重相”RNA中的拷贝数，验证雷帕霉素对特定mRNA翻译效率的影响。
   • 定量实时PCR（qRT-PCR）： 用于验证特定细胞因子（如IL12p40, IL23p19, IL-10, USP18）的转录水平变化。
   • 蛋白质印迹（Western Blot）： 用于检测信号通路中关键蛋白的磷酸化状态。包括：mTORC1的下游靶点p70核糖体S6激酶（p70S6K）在Thr389和Ser371位点的磷酸化；糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）在其抑制性位点Ser9的磷酸化；以及MAPK通路中p38和p44/42的磷酸化。这些实验在感染后的不同时间点（4, 16, 24小时）进行，以描绘信号事件的动力学变化。
   • 细胞因子检测： 使用细胞因子微珠阵列（CBA）或ELISA法检测细胞培养上清中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-12、IL-10和IL-23的蛋白分泌水平。
   • 基因沉默和药理学抑制： 为了确认GSK-3β的功能，研究使用了小干扰RNA（siRNA）在DC中敲低GSK-3β的表达，并使用了GSK-3β化学抑制剂SB216763和p70S6K抑制剂PF4708671进行预处理，随后观察这些处理对雷帕霉素调控细胞因子产生的影响。

5. 数据分析流程： 芯片数据通过主成分分析（PCA）和样本相关性聚类评估数据质量。利用R语言环境和Bioconductor软件包（如limma进行差异分析，clusterProfiler进行通路富集分析）进行生物信息学分析。统计显著性检验多采用单因素重复测量方差分析（ANOVA），事后比较采用Tukey检验。

主要结果 1. 雷帕霉素选择性重塑MTB感染DC的转录组和翻译组景观： PCA和聚类分析显示，总RNA和“重相”RNA样本、以及感染与非感染样本之间均呈现清晰的分离模式。在MTB感染的DC中，转录组和翻译组分别鉴定出228和404个DEGs。加入雷帕霉素后，DEGs数量增加至378（转录组）和729（翻译组）。重要的是，大多数转录组水平的DEGs也出现在翻译组DEGs列表中，表明MTB诱导转录的mRNA被有效地装载到多聚核糖体上进行翻译。

1. 通路富集分析揭示免疫相关通路被特异性调控： GO和通路富集分析显示，MTB感染（无论是否用雷帕霉素）主要富集于细胞因子产生、细胞因子信号传导和先天免疫应答等通路。而翻译组分析进一步揭示了I型干扰素（IFN）信号通路和对其他生物防御反应的特异性富集。值得注意的是，雷帕霉素的加入使翻译组中“IFN信号通路”和“抗病毒机制”等通路的富集更加显著。

2. 雷帕霉素促进I型和III型IFN及其刺激基因（ISG）mRNA的翻译： 翻译组数据显示，雷帕霉素显著上调了MTB感染DC中一批ISG mRNA与多聚核糖体的结合。数字PCR验证证实，IFN-β1和IFN-λ1的mRNA在“重相”中的拷贝数在雷帕霉素处理后显著增加。同时，多个ISG（如IFIH1/MDA5, IFIT3, IRF7）的翻译活性也因雷帕霉素而增强。此外，雷帕霉素下调了负向调控IFN信号的基因USP18的转录水平。这些结果共同表明，雷帕霉素通过促进IFN及其效应分子的翻译，在MTB感染的DC中强化了I/III型IFN信号特征。

3. 雷帕霉素通过mTORC1/GSK-3β轴调控促炎与抗炎细胞因子平衡：

   • 细胞因子谱变化： 转录组和蛋白水平验证均表明，MTB感染本身能诱导IL-12、IL-23、IL-1β、TNF-α、IL-6等多种促炎/调节性细胞因子，以及抗炎细胞因子IL-10。雷帕霉素的加入进一步显著增强了IL-12、IL-23、IL-1β和TNF-α的产生，同时显著降低了IL-10的分泌。
   • 关键信号节点发现： 蛋白质印迹动力学实验显示，MTB感染迅速而持久地激活了p70S6K（Thr389磷酸化增加），并导致GSK-3β在其抑制性Ser9位点的磷酸化水平逐渐增加（即GSK-3β活性被抑制）。雷帕霉素处理有效地逆转了这一过程：它降低了p70S6K的磷酸化，减少了GSK-3β的抑制性磷酸化，并增加了GSK-3β底物糖原合成酶（GS）的磷酸化，表明GSK-3β活性得以恢复。
   • 功能验证： 使用GSK-3β抑制剂SB216763或通过siRNA敲低GSK-3β，均完全阻断了雷帕霉素对细胞因子平衡的调节作用（即失去了促炎因子上调和IL-10下调的效果）。相反，抑制p70S6K则与雷帕霉素协同增强了促炎细胞因子的产生。使用Torin1（抑制mTORC1和mTORC2）则得到了与雷帕霉素不同的效果：它未能像雷帕霉素一样增强IL-12分泌，反而增加了IL-10的水平。这提示雷帕霉素的免疫刺激作用特异性地依赖于对mTORC1的抑制。

结论与意义 本研究的核心结论是：在MTB感染的人原代DC中，雷帕霉素通过抑制mTORC1，发挥了双重免疫调节作用。其一，它作为一种选择性的翻译诱导剂，促进了I型和III型IFN以及一系列ISG的mRNA与多聚核糖体的结合，从而增强了宿主的抗病毒/抗菌防御基因表达程序。其二，也是更关键的，它通过解除p70S6K对GSK-3β的抑制，恢复了GSK-3β的活性。活化的GSK-3β作为一个分子开关，改变了转录共激活因子CBP/p300在CREB（与抗炎基因相关）和NF-κB（与促炎基因相关）之间的分配平衡，最终导致促炎/调节性细胞因子（如IL-12, IL-23）的产生增加，而抗炎细胞因子IL-10的产生减少。

这项研究的科学价值在于，它首次在全局层面（转录组和翻译组）系统阐明了雷帕霉素在MTB感染的人类专职抗原提呈细胞（DC）中的免疫调节机制，并将mTORC1的信号传导与GSK-3β的活性调控及下游细胞因子网络的精细编排联系起来，填补了该领域分子机制的空白。其应用价值在于为结核病的宿主导向疗法提供了新的理论依据和潜在的靶点。研究结果表明，雷帕霉素及其类似物（rapalogs），以及GSK-3β的调节剂，有望成为辅助现有抗生素疗法的HDT候选策略，通过重编程宿主免疫反应（偏向保护性的Th1反应）来更有效地控制MTB感染。该发现也可能对其他涉及免疫失衡的感染性疾病或炎症性疾病的治疗具有启发意义。

研究亮点 1. 研究视角新颖： 不仅关注基因转录水平的变化，还创新性地结合了翻译组学分析，揭示了雷帕霉素在蛋白质翻译效率层面对免疫基因表达的特异性调控，这比单纯的转录组分析更能反映功能的最终输出。 2. 机制阐述深入： 成功地将mTORC1信号、p70S6K、GSK-3β活性、细胞因子转录平衡（CREB/NF-κB竞争CBP）等多个信号节点串联成一个清晰的调控轴（mTOR/GSK-3β轴），完整地解释了雷帕霉素效应的上下游因果链条。 3. 实验验证充分： 在高通量筛选的基础上，综合运用了数字PCR、蛋白质印迹动力学分析、基因沉默和特异性抑制剂等多种技术，从多个角度对关键假设进行了严谨验证，使结论非常坚实。 4. 临床转化潜力明确： 研究直接针对临床难题——结核病的治疗，提出的mTORC1和GSK-3β作为宿主靶点，为开发新型免疫调节疗法提供了直接且有力的实验证据。

其他有价值的内容 研究还附带提到，除了通过气溶胶给药方式将雷帕霉素与抗结核药物联用可能具有治疗潜力外，这些发现对于其他呼吸道感染（如冠状病毒感染）也可能具有参考价值，因为调节自噬和mTOR/GSK-3β轴或许能产生一定的治疗效果。这拓宽了该研究发现的潜在应用范围。