本研究由Muhammad Imran、Luping Zhang、Bohan Zheng、Zikai Zhao、Dengyuan Zhou、Shengfeng Wan、Zheng Chen、Hongyu Duan、Qiuyan Li、Xueqin Liu、Shengbo Cao、Shaoyong Ke和Jing Ye等人合作完成。其中，Muhammad Imran与Luping Zhang为共同第一作者，主要完成实验方法设计、数据整理和初稿撰写；通讯作者为华中农业大学农业微生物学国家重点实验室的Jing Ye和湖北省生物农药工程研究中心的Shaoyong Ke。参与单位包括华中农业大学动物医学院、巴基斯坦费萨拉巴德农业大学兽医科学学院、河南省人民医院肾病科、江西省动物健康重点实验室、江西农业大学动物科学技术学院、华中农业大学水产学院以及湖北省农业科学院等。该研究于2022年发表在Virologica Sinica第37卷第94至106页，文章标题为“Screening of novel synthetic derivatives of dehydroepiandrosterone for antivirals against flaviviruses infections”。
一、研究背景与目的
黄病毒（flaviviruses）是一类由节肢动物传播的重要人畜共患病原体，其中日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）、寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）、西尼罗病毒、登革病毒和黄热病毒等对人类公共卫生构成严重威胁。JEV是亚太地区儿童病毒性脑炎的主要病因，每年约报告68,000例病例，其中10,000至15,000例死亡；ZIKV在2014至2016年间在巴西等地大规模暴发，并与新生儿小头畸形和成人格林-巴利综合征等神经系统疾病相关。尽管已有部分疫苗上市，但目前尚无获批的抗黄病毒特效药物，临床治疗主要依赖解热、镇痛和抗炎等对症支持。因此，迫切需要开发新型抗病毒药物。
脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone, DHEA）是人体内含量丰富的内源性甾体激素，已有研究表明其具有抗病毒、抗免疫紊乱和抗肿瘤等作用。然而，长期使用DHEA可能导致女性体内睾酮和二氢睾酮水平升高，引起男性化等副作用。为规避这一缺陷，研究者合成了一系列DHEA结构类似物，希望保留抗病毒活性但不转化为性激素。本研究旨在筛选32种DHEA合成衍生物中具有抗JEV和ZIKV活性的候选化合物，并初步阐明其作用机制。
二、研究流程
研究首先以JEV为模型，在BHK-21细胞上进行了基于空斑减少试验（plaque reduction assay）的初筛。将32种DHEA衍生物以10 μmol/L的终浓度分别加入JEV感染（0.1 MOI）的BHK-21细胞中，24 h后收集上清并测定病毒滴度。结果显示，与母体DHEA相比，编号为HAAS-AV3023、HAAS-AV3024、HAAS-AV3025、HAAS-AV3026、HAAS-AV3027和HAAS-AV3028的六种化合物显著降低了JEV感染滴度，被初步判定为命中化合物。
随后，通过基于ATP发光的细胞活力检测（CellTiter-Glo）评价上述六种化合物对BHK-21和Vero细胞的细胞毒性，计算半数细胞毒性浓度（CC50）。结果表明，HAAS-AV3025、HAAS-AV3026和HAAS-AV3027在BHK-21细胞中的CC50分别为66.87、97.63和94.58 μmol/L，而HAAS-AV3023、HAAS-AV3024和HAAS-AV3028的CC50较低，分别为22.83、12.39和8.43 μmol/L。在Vero细胞中，HAAS-AV3026和HAAS-AV3027仍表现出较高的CC50值。结合初筛抗病毒活性和细胞毒性结果，选择HAAS-AV3026和HAAS-AV3027作为先导化合物进行后续研究。
在剂量依赖性实验中，Vero细胞感染JEV或ZIKV（0.1 MOI）后，分别用不同浓度（1、10、50和100 μmol/L）的HAAS-AV3026或HAAS-AV3027处理，24 h后通过空斑试验测定病毒滴度并计算半数抑制浓度（IC50）。结果显示，HAAS-AV3026和HAAS-AV3027对JEV的IC50分别为2.13和1.98 μmol/L，对ZIKV的IC50分别为3.73和3.42 μmol/L。同时，免疫荧光试验（immunofluorescence assay, IFA）观察到随着药物浓度增加，JEV和ZIKV在Vero细胞中的荧光信号逐渐减弱，说明病毒扩散受到抑制。此外，为验证化合物在人类细胞系中的抗病毒效果，研究还在A549细胞上进行了细胞毒性检测和空斑试验，结果显示HAAS-AV3026和HAAS-AV3027对A549细胞的CC50分别为71.75和70.53 μmol/L，且对JEV和ZIKV具有剂量依赖性抑制作用。以上结果说明两种化合物在非人灵长类和人类细胞系中均能有效抑制黄病毒增殖。
三、主要结果
研究进一步评估了HAAS-AV3026和HAAS-AV3027在不同感染复数（multiplicity of infection, MOI）和不同时间点对JEV和ZIKV增殖的抑制作用。在不同MOI（0.1、1和10）感染实验中，两种化合物（10 μmol/L）在所有MOI水平下均显著降低了JEV和ZIKV的病毒滴度。在一步生长曲线实验中，Vero细胞以5 MOI感染JEV或ZIKV，并在感染后1 h加入化合物，分别于0、3、6、12、18和24 h收集细胞和上清。结果表明，对照组病毒滴度在6至12 h开始上升，在18至24 h持续增加；而药物处理组在细胞内和细胞外病毒滴度均显著低于对照组。此外，在0.1和1 MOI条件下，两种化合物在感染后24、48和72 h均能持续抑制JEV和ZIKV的病毒释放，表现出长效抗病毒活性。
为明确化合物对病毒蛋白和RNA合成的影响，研究采用蛋白印迹（Western blot）和定量逆转录PCR（qRT-PCR）检测。在Vero细胞以5 MOI感染JEV或ZIKV并用10 μmol/L化合物处理后，Western blot结果显示HAAS-AV3026和HAAS-AV3027在12、18和24 h显著降低了JEV和ZIKV包膜蛋白E和非结构蛋白NS5的表达。qRT-PCR结果同样表明，两种化合物在12、18和24 h显著抑制了JEV和ZIKV病毒RNA的合成。上述结果提示，DHEA衍生物通过抑制病毒蛋白和RNA合成来阻断病毒复制。
在作用机制研究中，时间添加实验（time-of-drug addition assay）显示，HAAS-AV3026和HAAS-AV3027在感染前1 h处理对JEV和ZIKV滴度无明显影响；在感染同时加入药物仅有轻度抑制作用；而在感染后1、6和12 h加入药物则表现出显著抑制效果。进一步通过病毒吸附试验和进入试验发现，两种化合物不影响JEV和ZIKV与宿主细胞的结合及进入过程。利用JEV复制子（replicon）转染BHK-21细胞后加入化合物，结果显示在转染后24 h荧光素酶活性显著降低，表明化合物直接抑制了病毒复制阶段。HAAS-AV3026和HAAS-AV3027主要作用于黄病毒复制周期的复制阶段，而非吸附和进入阶段。
四、结论与意义
本研究通过空斑减少试验从32种DHEA合成衍生物中筛选出HAAS-AV3026和HAAS-AV3027两种具有显著抗JEV和ZIKV活性的候选化合物。两种化合物在BHK-21、Vero和A549细胞中均表现出较低的细胞毒性，并在Vero和A549细胞中对JEV和ZIKV具有剂量依赖性抑制作用。机制研究显示，这两种化合物不影响病毒与细胞的结合和进入，而是通过抑制病毒复制阶段来降低病毒RNA和蛋白合成。研究提示HAAS-AV3026和HAAS-AV3027具有作为抗黄病毒候选药物的潜力，为后续基于DHEA结构优化和抗病毒药物开发提供了实验依据。
五、研究亮点
本研究的亮点包括：第一，首次系统筛选了32种DHEA合成衍生物的抗JEV活性，并发现了HAAS-AV3026和HAAS-AV3027两个高效、低毒的先导化合物；第二，通过时间添加试验、病毒吸附和进入试验以及JEV复制子试验，明确了化合物主要作用于病毒复制阶段，而非早期结合和进入阶段；第三，验证了化合物在非人灵长类细胞和人类细胞系中的双重抗病毒效果，为临床前开发提供了重要数据支撑。