本文档属于类型C，即实验方法类文献，主要提供腺病毒（adenovirus）载体构建及应用的详细操作流程。以下为文档核心内容的系统梳理与要点提取：
一、核心作者与机构
本文由Yangyang Liu（华中科技大学同济医学院附属协和医院癌症中心；波士顿儿童医院内分泌科）、Simiao Xu（同济医院内分泌科）、Yun Liu（广州医科大学）、Yashaswini Kelagere Mayige Gowda（印度Sapthagiri医学研究中心）及Ji Miao（哈佛医学院波士顿儿童医院）共同完成，发表于Methods in Molecular Biology（2022年）。研究受美国国立卫生研究院（NIH R01DK124328）资助。
二、研究背景与目标
背景：非酒精性脂肪性肝炎（NASH）可进展为肝癌或肝衰竭，但目前尚无FDA批准的治疗药物。研究者需通过功能增益（gain-of-function）或功能缺失（loss-of-function）实验解析其分子机制，而腺病毒载体因其高效、瞬时转导特性成为关键工具。
目标：提供腺病毒载体从构建、扩增、纯化到体内外应用的标准化流程，支持NASH机制研究与基因治疗开发。
三、技术流程详解
1. 腺病毒载体构建
- 同源重组策略：
- 体外重组：使用Block-it U6系统，通过LR Clonase II酶将shRNA（short hairpin RNA）插入腺病毒骨架载体（如pAd/Block-it-DEST），转化至大肠杆菌（E. coli Top10或XL10 Gold）筛选阳性克隆。
- 细菌内重组：利用AdTrack-CMV系统，通过电穿孔将线性化载体与pAdEasy-1质粒共转化至BJ5183-AD大肠杆菌，经Pac I酶切验证重组质粒（30 kb大片段+3-4.5 kb小片段）。
- 一步法构建：使用RAPAd CMV系统，将目的基因（GOI）与骨架载体（如pAd5-CMV-GOI-IRES-GFP）共转染293AD细胞，直接生成重组病毒。
2. 病毒生产与纯化
- 293AD细胞扩增：转染后7-14天观察细胞病变效应（CPE），收集细胞裂解液，经3次冻融循环释放病毒。
- CsCl梯度离心：
- 低密度（1.25 g/ml）与高密度（1.40 g/ml）CsCl溶液分层，超速离心（175,000×g, 16小时）分离病毒带。
- 透析去除CsCl，加入含甘油的存储缓冲液（10 mM Tris-HCl, 0.1% BSA），-80°C保存。
3. 病毒滴度测定
- 物理滴度：通过A260吸光度计算病毒颗粒数（VP/ml），公式：A260×20×1.1×10¹²。
- 功能滴度：终点稀释法（end-point dilution）感染293细胞，统计CPE阳性孔，计算噬斑形成单位（PFU/ml）。
4. 肝细胞与肝脏感染
- 体外感染：原代小鼠肝细胞以MOI（multiplicity of infection）=1-10感染，48小时内分析基因表达。
- 体内感染：小鼠经尾静脉或眼眶后静脉注射（0.5-2×10⁹ PFU/只），3-14天后取肝脏验证靶基因修饰（如Cre/loxP系统删除TAZ基因）。
四、关键注意事项
- 安全性：腺病毒为生物安全二级（BSL-2）病原体，操作需符合机构规范。
- 优化参数：
- 原代肝细胞对病毒敏感，需通过预实验确定最佳MOI（避免细胞毒性）。
- 体内注射需控制病毒剂量，防止过量引发炎症反应。
- 质量控制：重组质粒需经测序验证，病毒扩增不超过5-6代以避免复制型病毒（RCV）产生。
五、应用价值与创新点
- 科学价值：标准化流程可加速NASH机制研究，如通过NRG4（Neuregulin 4）或DUSP9（Dual-specificity phosphatase 9）基因修饰探索治疗靶点。
- 技术亮点：
- 兼容多种基因操作（过表达、shRNA敲低、CRISPR敲除）。
- 支持多基因共转导（如GFP报告基因与目的基因共表达）。
- 临床潜力：腺病毒载体已用于500余项基因治疗临床试验，本文方法为临床前研究（如非人灵长类模型）提供基础。
六、重要图表与参考文献
- 图1：展示腺病毒感染原代肝细胞（GFP表达）及小鼠肝脏（TAZ基因删除）的效果。
- 引用文献：包括腺病毒受体发现（Bergelson等，1997）、载体优化（Crystal，2014）及NASH模型应用（Guo等，2017）。
（全文约2000字，涵盖技术细节与逻辑链条，可供分子生物学及肝脏疾病领域研究者直接参考。）