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一、研究团队与发表信息

本研究由意大利多所顶尖科研机构合作完成，通讯作者为Irene Bozzoni（来自意大利技术研究院Fondazione Istituto Italiano di Tecnologia (IIT)及罗马大学Sapienza University of Rome）和Gaia Di Timoteo（罗马大学）。研究团队还包括Martina Chiara Biagi、Andrea Giuliani等作者。论文于2025年5月16日以预印本形式发布于bioRxiv，DOI编号为10.¹¹⁰¹⁄₂₀₂₅.05.13.653105，目前尚未经过同行评审。

二、学术背景与研究目标

科学领域与背景知识

研究聚焦于环状RNA（circular RNA, circRNA）的翻译机制优化。circRNA是一类首尾共价闭合的非编码RNA，因其结构稳定、抗外切酶降解的特性，在基因调控和疾病治疗中具有潜力。然而，其无帽翻译（cap-independent translation）效率低，且长链circRNA的大规模生产困难，限制了其临床应用。

研究动机与目标

此前，circRNA翻译依赖长链内部核糖体进入位点（IRES，600-800核苷酸）或化学修饰，但这类方法存在效率与规模化瓶颈。本研究旨在鉴定更短的翻译调控元件，以提升circRNA的翻译效率，并解决其作为治疗药物的技术障碍。

三、研究方法与流程

1. 载体构建与元件筛选

• 核心载体：采用p-circ-3xF质粒（含3xFlag标签的GFP开放阅读框），通过反向PCR线性化后，插入不同IRES（如EMCV、CVB3病毒IRES和人类VCIP IRES）或翻译增强元件（TEEs）。
  
• 新型短元件设计：基于已知的13核苷酸（13-mer）TEE核心序列，结合β-珠蛋白UTR片段或内源性circZNF609的UTR片段，构建了63核苷酸的复合元件（13-UTR3）。
  
• 实验对照：设置线性RNA（含帽结构）与空载体对照，比较翻译效率。
  

2. 细胞模型与转染

• 细胞系：使用横纹肌肉瘤细胞（RD）和神经母细胞瘤细胞（SK-N-BE），分别模拟肌肉和神经组织环境。
  
• 转染条件：通过脂质体转染2.5 μg质粒，48小时后收集细胞进行RNA和蛋白分析。
  

3. 翻译效率评估

• RNA水平检测：通过qPCR定量circRNA及其前体，标准化至GAPDH或ACTB内参。
  
• 蛋白水平检测：Western blot检测Flag标签蛋白，定量翻译产物。
  
• 稳定性测试：用α-鹅膏蕈碱（α-amanitin）抑制转录，比较circRNA与线性RNA的半衰期。
  

4. 数据分析

• 统计方法：采用双尾t检验比较不同元件的翻译效率（蛋白/RNA比值），显著性阈值设为*p<0.05*。
  

四、主要研究结果

1. 短元件的高效翻译能力

• VCIP IRES优于病毒IRES：在RD细胞中，人类VCIP IRES的翻译效率比EMCV高2倍（*p<0.01*），且circRNA产量更高（图1B）。
  
• 13-UTR3元件的突破性表现：63核苷酸的13-UTR3组合（13-mer + circZNF609 UTR3片段）比VCIP IRES效率提升1.5倍（*p<0.001*），且circRNA产量增加3倍（图1G）。
  

2. 翻译效率的ORF与细胞类型无关性

• 跨ORF验证：在circZNF609的ORF中，13-UTR3驱动双起始密码子（35 kDa和30 kDa蛋白）的翻译效率均显著高于天然UTR（图2A）。
  
• 跨细胞验证：在SK-N-BE神经细胞中，13-UTR3仍保持最高翻译活性（图2B），证明其普适性。
  

3. circRNA的稳定性优势

• 线性RNA在24小时内降解70%，而circRNA保持稳定（图1F），支持其作为长效治疗载体的潜力。
  

五、研究结论与价值

科学意义

• 短翻译元件的发现：63核苷酸的13-UTR3解决了长链IRES的空间限制，为circRNA设计提供了更灵活的框架。
  
• 机制创新：首次证明TEE与内源性UTR片段协同增强circRNA翻译，拓展了非编码RNA的功能认知。
  

应用价值

• 治疗载体优化：短元件可容纳更长的治疗性ORF（如抗体或疫苗抗原），推动circRNA在肿瘤、神经疾病和传染病（如COVID-19疫苗）中的应用。
  
• 生产可行性：短circRNA更易体外合成，降低工业化生产成本。
  

六、研究亮点

1. 最小化调控元件：63核苷酸的13-UTR3是迄今报道的最短高效circRNA翻译驱动元件。
   
2. 多模型验证：在肌肉和神经细胞中均证实效率，支持其跨组织适用性。
   
3. 稳定性与效率平衡：克服了传统线性RNA半衰期短与翻译效率低的双重瓶颈。
   

七、其他重要内容

• 潜在优化方向：未来可通过高通量筛选进一步优化UTR spacer，或结合m6A修饰（m6A modification）提升翻译效率。
  
• 伦理与安全：研究未涉及体内实验，后续需评估circRNA的免疫原性和毒性。
  

（报告总字数：约1800字）