本研究由Yu Han等人完成，第一作者单位为河北儿童医院药学部，合作单位包括河北医科大学第四医院泌尿外科、河北医科大学实验动物科学学部及河北医科大学药学院。该论文发表于《Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening》2024年第27卷第14期，文章页码为2078–2089，出版日期为2024年。

本研究属于中药复方治疗糖尿病肾病的网络药理学与实验验证研究。糖尿病肾病是糖尿病最常见的微血管并发症之一，以尿白蛋白升高和肾功能损害为特征，是终末期肾病的主要原因。由于糖尿病肾病发病机制涉及炎症、氧化应激、代谢异常、生长因子及遗传和表观遗传等多种因素，单一靶点治疗难以取得理想效果。中药复方具有多成分、多靶点、多通路整体调节的优势。黄芪和山茱萸是中医治疗糖尿病肾病的常用药对，已有临床经验显示其对不同阶段糖尿病肾病具有一定疗效，但两者配伍后的具体药理学机制尚不清楚。为此，本研究采用网络药理学方法，结合动物实验和分子对接技术，系统探讨黄芪-山茱萸药对治疗糖尿病肾病的作用机制。

研究流程主要包括三个层面：网络药理学预测、动物实验验证和分子对接验证。首先，研究从TCMSP数据库中筛选黄芪和山茱萸的活性成分，筛选标准为口服生物利用度不低于30%且类药性不低于0.18。结果共获得40个候选活性成分，其中黄芪20个、山茱萸20个，对应潜在靶点180个。与此同时，研究从GeneCards、OMIM、PharmGKB和TTD数据库中检索糖尿病肾病相关靶点，共获得1115个疾病相关靶点。通过Venn分析获得81个黄芪-山茱萸药对与糖尿病肾病的交集靶基因。利用Cytoscape 3.9.0构建“药材-疾病-靶点”网络，该网络包含107个节点和220条边，其中槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等活性成分具有较高连接度，提示这些成分可能在治疗中发挥核心作用。进一步通过STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用网络，并用Cytoscape分析筛选出前10位核心基因，包括VEGFA、AKT1、IL6、IL1B、TP53、MMP9、PTGS2、CASP3、EGF和EGFR。GO富集分析显示，交集基因主要富集于对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、营养水平反应、活性氧代谢过程等生物学过程；细胞组分方面主要涉及膜筏、膜微区、小窝及RNA聚合酶II转录因子复合物；分子功能方面富集了细胞因子活性、细胞因子受体结合、类固醇激素受体活性等。KEGG通路富集分析揭示这些靶基因主要参与流体剪切力与动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路等。其中AGE-RAGE信号通路在糖尿病肾病发病中具有重要作用，高血糖促进晚期糖基化终末产物积累并激活RAGE，进而调节下游p38、MAPK和NF-κB等信号通路，促进氧化应激、炎症和纤维化，导致肾脏结构和功能异常。

在动物实验验证部分，研究采用12周龄雄性BALB/c小鼠，随机分为空白组、模型组和治疗组，每组5只。模型组和治疗组小鼠通过腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型，造模成功标准为血糖不低于16.7 mmol/L。治疗组每日灌胃给予黄芪6 g/kg和山茱萸3 g/kg，模型组和空白组给予等体积去离子水，持续21天后取肾组织进行检测。HE染色结果显示，模型组小鼠肾小球体积增大、系膜基质扩张、肾小管上皮细胞变性、管腔扩张、毛细血管腔狭窄，并可见炎症细胞浸润及肾小球硬化；治疗组肾组织形态明显改善。qPCR和免疫组化结果表明，模型组IL-1和IL-6的mRNA及蛋白表达显著高于空白组，而治疗组IL-1和IL-6表达显著低于模型组。Western blot结果显示，三组间JNK1总蛋白表达无显著差异，但模型组p-JNK（Thr183/Tyr185）表达显著升高，治疗组p-JNK水平显著下降。上述结果提示黄芪-山茱萸药对可能通过抑制JNK1磷酸化，下调IL-1和IL-6表达，从而减轻糖尿病肾病炎症损伤。

分子对接实验中，研究选择KEGG富集分析中与糖尿病肾病相关的靶点JNK1与黄芪活性成分山柰酚进行对接。结果显示山柰酚与JNK1的对接能量为−6.0 kJ/mol，表明两者具有较好的结合活性。山柰酚与JNK1的结合区域包括Arg-69、Lys-55、Lys-153、Asn-156、Thr-188和Tyr-185，其中Tyr-185为JNK1的磷酸化位点。该结果进一步支持动物实验中观察到的黄芪-山茱萸药对抑制JNK1磷酸化的机制。

本研究的结论是：黄芪-山茱萸药对通过多成分、多靶点、多通路发挥对糖尿病肾病的治疗作用，其机制与AGE-RAGE等信号通路有关。动物实验和分子对接证实，黄芪中的山柰酚可通过直接结合JNK1并抑制其磷酸化，进而抑制JNK/AP-1信号通路，减少IL-1和IL-6的表达，减轻肾脏炎症反应。该研究为黄芪-山茱萸药对在糖尿病肾病中的临床应用提供了药理学依据，也为基于该药对的新药研发提供了理论支持。

本研究的亮点在于将网络药理学预测与动物实验及分子对接验证相结合，构建了从活性成分筛选、靶点预测、通路富集到实验验证的完整研究链条。研究方法系统，逻辑清晰，数据相互印证，揭示了中药复方多成分协同作用的潜在机制。同时，研究还发现了山柰酚与JNK1磷酸化位点的直接结合关系，为中药活性成分的靶点机制研究提供了直接实验证据。该研究也存在一定局限性，如活性成分和靶点来自数据库预测，尚未通过LC/MS等实验手段对黄芪-山茱萸药对活性成分进行实际分析；分子对接仅提供蛋白-配体结合能力的初步预测，需进一步采用分子动力学模拟和微量热泳动等技术验证；研究结果尚需临床试验进一步确认。